電針對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠下丘腦β淀粉樣蛋白、Tau蛋白磷酸化水平與糖原合成酶激酶-3的影響*

王靜芝，杜艷軍△，陳 麗，黃瀏嬌，瞿 濤，周煥嬌，陳 茜

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院/針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430061；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，武漢 430061)

隨著人口老齡化日益嚴(yán)重, 老年期癡呆的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。輕度認(rèn)知功能損害(mild cognitive impairment, MCI)是介于正常老化和癡呆之間的一種不穩(wěn)定的認(rèn)知損傷狀態(tài)，每3～4年有20%～66%的MCI患者認(rèn)知功能持續(xù)惡化，最終導(dǎo)致癡呆的發(fā)生，其中大部分為阿爾茨海默型癡呆(alzheimer disease，AD)，MCI是AD的重要危險(xiǎn)因素[1-2]。胰島素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響包括攝食行為、能量?jī)?chǔ)存、記憶認(rèn)知功能[3]，中樞胰島素抵抗(insulin resistance, IR)可以引起輕度認(rèn)知功能損害，輕、中度認(rèn)知功能下降[4]。

Aβ是由淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用產(chǎn)生，Aβ的増加與沉積可通過生成具有神經(jīng)毒性的老年斑誘發(fā)神經(jīng)元變性與死亡。神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白(Tau蛋白)過度磷酸化則是認(rèn)知功能損害的又一發(fā)病機(jī)制[5-6]。胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PKB/Akt的生理底物糖原合成酶激酶-3(glucogen synthase kinase-3,GSK3)，具有GSK-3α和GSK-3β 2種形式的異構(gòu)體，其活性與Aβ沉積、tau蛋白過度磷酸化密切相關(guān)[7]。

本研究在造模同時(shí)給予受試動(dòng)物電針預(yù)防性治療，與造模成功后的電針治療組作為對(duì)照，旨在觀察電針預(yù)防性治療對(duì)胰島素抵抗大鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用。并通過觀察各組大鼠下丘腦Aβ42、p-tau、GSK-3α與GSK-3β表達(dá)變化與差異，探討電針治療在防治胰島素抵抗大鼠輕度認(rèn)知功能損害的效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用清潔級(jí)雄性Wistar大鼠70只，8周齡，體質(zhì)量(180±20) g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(鄂)2015-0018。飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～25 ℃，濕度45%～55%。

1.2 主要試劑與儀器

高脂飼料 (上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)，Aβ42、p-Tau(美國(guó)abcam，b10148、ab109390)，Dako REAL EnVision Detection System(安捷倫(Dako)，K5007)。小鼠單抗β-actin(42KD)(武漢博士德生物工程有限公司，BM0627)，兔多抗GSK3α(51KD)、兔多抗GSK3β(48KD)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，13419-1-AP、 22104-1-AP)，HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，BA1051、BA1054)，磷酸酶抑制劑、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天，S1873、ST506、P0013B、P0010)，TEMED、Trise-Base(Amresco，Amresc00761、Exp2017/12), HCl(信陽市化學(xué)試劑廠，GB622-89), Tris-base(西格瑪奧的(上海)貿(mào)易有限公司，v900483)。

RM 2016輪轉(zhuǎn)式病理切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；JK-6生物組織攤烤片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；SKG抗原修復(fù)用電陶爐；電泳儀(Bio-Rad)；轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)；凝膠掃描成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；BX53型顯微鏡(奧林巴斯生物顯微鏡)，LP115pH計(jì)(德國(guó)Metter-Toledo GmbH公司)；酶標(biāo)儀(Thermo，mμLISKANMK3)；HI650離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；華佗牌毫針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.3 分組與造模

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組(normal, N)、模型組(model, M)、預(yù)防組(preventing electro-acupuncture, p-EA)、電針組(electro-acupuncture,EA)、預(yù)防+阻滯劑組(p-EA+blocker LY294002, p-EA+b)、電針+阻滯劑組(EA+blocker LY294002，EA+b)、腦脊液組(cerebrospinal fluid, CSF)各10只。正常組(N)給予標(biāo)準(zhǔn)飲食(3.8kcal/g，含70%碳水化合物，20%蛋白質(zhì)，10%脂肪)，其余各組采用高脂飼料(5.4kcal/g，含38.5%碳水化合物，15%蛋白質(zhì)，46.5%脂肪)。喂養(yǎng)8周后大鼠尾靜脈采血檢測(cè)FPG、FINS，IRI=[FPG (mmol/L)×FINS (mIU/L)]/22.5，模型大鼠IRI與正常大鼠比較明顯升高時(shí)(P<0.001)為造模成功[8]。

1.4 電針干預(yù)

1.4.1 EA組 大鼠于造模成功后，使用 0.30×25 mm不銹鋼毫針，參照李忠仁主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9], 以標(biāo)本配穴電針方法選擇關(guān)元、足三里(后三里)、豐隆和百會(huì)進(jìn)行毫針針刺。足三里和豐隆穴直刺5～10 mm，關(guān)元穴向劍突方向斜刺5～7 mm，百會(huì)向后方平刺5 mm。采用電針治療儀(HANS-100 A型)連續(xù)波、頻率(2 Hz)、強(qiáng)度(1 mA)、通電(10 min)，同側(cè)足三里穴和豐隆穴連接同一輸出的2個(gè)電極，刺激強(qiáng)度根據(jù)局部肌肉收縮情況決定。每日電針10 min，每周5次治療，總療程為8周。以上采取的刺激頻率和電針時(shí)間、療程綜合文獻(xiàn)報(bào)道決定[10]。

1.4.2 p-EA組 從造模開始進(jìn)行電針治療，電針方法同EA組，持續(xù)16周。

1.4.3 p-EA+b組 大鼠稱重后以10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔麻醉。將大鼠固定于腦立體定位儀，頭頂局部常規(guī)備皮、消毒，依照立體定位圖譜進(jìn)行定位，于前囟后0.8 mm在中位顱蓋骨處用牙科鉆鉆一直徑2 mm的孔[11-12],以不銹鋼導(dǎo)管插入(長(zhǎng)18.0 mm，外徑0.64 mm，內(nèi)徑0.39 mm)留置(如圖1)；用帶帽的不銹鋼制導(dǎo)絲插入導(dǎo)管內(nèi)封閉導(dǎo)管。手術(shù)后預(yù)防感染，將大鼠置于空籠內(nèi)待6～8 h可清醒。術(shù)后2 d起取LY294002 (10 μm, 10 μL；1 μL/min)緩慢注射，留針8～10 min，以防藥物沿針道返流顱外。電針治療同p-EA組，共計(jì)16周。

1.4.4 EA+b組 造模成功后，每日電針干預(yù)前1 h，大鼠稱重后進(jìn)行腦室灌注LY294002。腦室灌注同p-EA+b組。電針治療同EA組，持續(xù)8周。

1.4.5 CSF組 大鼠稱重后腦室留管同EA+b組。腦脊液：Na+145.5 ml/L, K+2.8 mol/L, Ca2+2.3 mol/L, Mg2+2.2 mol, Cl-128.5 mol/L, HCO3-23.1 mol/L, H2Po4-l.lmol/L, 葡萄糖0.6lg/L, 滲透壓289.omosM/L, PH 值7.3配置完成等量灌注，操作方法同EA+b組。電針治療同EA組。

圖1 大鼠腦立體定位及置管示意圖

1.5 指標(biāo)收集與檢測(cè)

1.5.1 ELISA法檢測(cè) 大鼠空腹FPG、FIN 實(shí)驗(yàn)16th周治療結(jié)束后，各組大鼠禁食12 h以尾靜脈采血靜置，離心取上清。ELISA 法按試劑盒操作要求檢測(cè)各組大鼠空腹FPG、FIN并計(jì)算各組大鼠IRI。

1.5.2 免疫組化 各組大鼠禁食12 h頸椎脫臼法處死，冰上剝?nèi)∠虑鹉X，右側(cè)下丘腦組織-80 ℃保存?zhèn)溆?。左?cè)下丘腦組織用多聚甲醛(4%)固定后，酒精脫水并進(jìn)行浸蠟及包埋。切片厚度4 μm，經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)，滴加一抗(Aβ42 1∶100，p-tau1∶100)、二抗，鏡下觀察并完成鏡檢拍照。使用IPP6.0軟件對(duì)免疫組化照片進(jìn)行光密度分析，每張切片選取3張400倍照片做光密度分析，area為面積，IOD為積分光密度，density(mean)為平均光密度。

1.5.3 Western blot檢測(cè) 從-80 ℃冰箱中取出下丘腦組織，加入400 μL裂解液(含PMSF)碾磨、裂解離心取上清，使蛋白變性。BSA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為1、0.8、0.6、0.4、0.2標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用DG-3022 A酶標(biāo)儀測(cè)定OD568并計(jì)算蛋白濃度。蛋白樣品(40μg)和Marker加入上樣孔，電泳1.5 h。凝膠根據(jù)Marker切下目的條帶，PVDF膜甲醇浸泡后同濾紙浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液。PVDF膜浸泡于含5%脫脂奶粉TBST，室溫?fù)u床封閉2 h；浸泡一抗(β-actin 1∶200，GSK3-α1∶500，GSK3-β1∶1000)，封閉液稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗(1∶50000)，采用BandScan分析膠片灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FPG、FINS與IRI水平變化比較

表1示，治療結(jié)束與N組比較，其他各組大鼠FPG、FINS與IRI明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與M組比較，p-EA組、EA組、p-EA+b組與CSF組大鼠FPG、FINS和IRI均有不同程度降低(P<0.05或P<0.01)；與EA組比較，p-EA組大鼠的FINS與IRI降低(P<0.05)，EA+b組FPG、FINS與IRI升高(P<0.05), p-EA+b組大鼠的FPG與IRI升高(P<0.05)；與EA+b組比較，p-EA與CSF組大鼠的FPG、FINS和IRI降低(P<0.05)，p-EA+b組大鼠的FINS與IRI升高(P<0.05)；與CSF組比較，p-EA+b組大鼠的FPG、FINS與IRI升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠FPG、FINS、IRI水平比較

2.2 各組大鼠下丘腦Aβ42與p-Tau表達(dá)比較

圖2示，第16周電針治療結(jié)束時(shí)，黑色箭頭所示棕黃色或棕褐色細(xì)胞膜是各組大鼠下丘腦Aβ42、p-Tau的陽性表達(dá)。N組與p-EA組大鼠下丘腦見極少量棕黃色或棕褐色淡染的陽性細(xì)胞；EA組、p-EA+b組與CSF組大鼠下丘腦偶見棕黃色或棕褐色淡染的陽性細(xì)胞；M組、EA+b組棕黃色或棕褐色陽性表達(dá)聚集數(shù)量多，著色深。

圖2 各組大鼠下丘腦Aβ42與p-Tau免疫組織化學(xué)(×400)

表2示，M組、p-EA組、EA組、EA+b組、p-EA+b組、CSF組大鼠Aβ42、p-Tau的陽性表達(dá)明顯高于N組(P<0.05或P<0.01)； p-EA組、EA組大鼠Aβ42、p-Tau的陽性表達(dá)低于M組、EA+b組、CSF組(P<0.05或P<0.01)； EA組與p-EA組大鼠之間Aβ42、p-Tau的陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；p-EA+b組與CSF組大鼠Aβ42陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組大鼠下丘腦Aβ42、p-Tau平均光密度比值及下丘腦GSK-3α、GSK-3β蛋白表達(dá)比較

2.3 各組大鼠下丘腦GSK-3α和GSK-3β蛋白表達(dá)比較

表2圖3示，與N組比較，其他各組大鼠下丘腦GSK-3α、GSK-3β蛋白表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01)；與M組比較，p-EA、EA組和p-EA+b組大鼠下丘腦GSK-3α、GSK-3β蛋白表達(dá)減少(P<0.05或P<0.01)，CSF組大鼠GSK-3α差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GSK-3β蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；與EA組比較，p-EA組大鼠下丘腦GSK-3α、GSK-3β蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，EA+b組、p-EA+b組CSF組大鼠下丘腦GSK-3α、GSK-3β蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；與EA+b組比較，p-EA組大鼠下丘腦GSK-3α(P<0.05)，p-EA+b組、CSF組大鼠下丘腦GSK-3β蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；與CSF組比較，EA+b組和p-EA+b組大鼠下丘腦GSK-3α、GSK-3β蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。

圖3 各組大鼠下丘腦GSK-3α和GSK-3β蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

胰島素與大腦的生物活性、神經(jīng)結(jié)構(gòu)和生理功能密切相關(guān)，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知功能有著重要影響，胰島素相關(guān)信號(hào)分子傳導(dǎo)異常是IR發(fā)生的關(guān)鍵[13]。IR時(shí)，由胰島素介導(dǎo)的神經(jīng)能量代謝出現(xiàn)異常引起神經(jīng)元糖代謝紊亂，從而導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[14]。

本研究依據(jù)中醫(yī)針灸“治未病”理論，以足三里、關(guān)元、豐隆與百會(huì)四穴配伍，旨在培補(bǔ)先天之本、后天氣血生化之源的同時(shí)，祛痰消脂、疏通腦絡(luò)。研究中預(yù)防組受試動(dòng)物在造模的同時(shí)給予電針治療，以期通過電針干預(yù)激發(fā)受試動(dòng)物機(jī)體內(nèi)在的抗病能力，預(yù)防IR與IR相關(guān)的認(rèn)知功能損害，強(qiáng)調(diào)電針早期干預(yù)的預(yù)防效應(yīng)。

GSK3是PI3K/Akt信號(hào)通路的生理底物，通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)該通路的效應(yīng)蛋白對(duì)IR的發(fā)生發(fā)展有重要影響。GSK-3α和GSK-3β是GSK3兩種形式的異構(gòu)體?；罨腉SK-3a可以激活A(yù)PPγ分泌酶使得Aβ沉積增加[15-16]，GSK-3β會(huì)造成tau蛋白過度磷酸化并導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)；此外，GSK-3β通過提高胰島素受體底物的絲/蘇氨酸磷酸化水平來抑制胰島素受體對(duì)胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化，通過抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)加重IR[17-18]。因此，GSK-3α與GSK-3β的活化是IR與認(rèn)知功能損害共同的病理改變。

本研究中，M組、EA+b組和p-EA+b組大鼠下丘腦GSK-3α與GSK-3β蛋白表達(dá)增加，這與其下丘腦中Aβ42與p-Tau陽性表達(dá)聚集數(shù)量多、著色深的結(jié)果一致。同時(shí)，這3組受試動(dòng)物外周血FPG、 FINS及IRI水平升高。電針治療后，p-EA組、EA組外周胰島素抵抗程度顯著降低，下丘腦Aβ42與p-Tau陽性表達(dá)減少，GSK-3α與GSK-3β蛋白表達(dá)降低，且p-EA組治療效果優(yōu)于EA組， p-EA組與EA組p-Tau陽性表達(dá)結(jié)果無明顯差異。在中樞微量注入PI3K抑制劑LY294002的條件下，電針防治效應(yīng)被阻斷，EA+b組、p-EA+b組大鼠的FPG、 FINS與IRI升高，Aβ42與p-Tau陽性表達(dá)聚集數(shù)量多、著色深，且GSK-3α與GSK-3β蛋白表達(dá)增加，說明電針對(duì)IR大鼠認(rèn)知功能損傷的防治效應(yīng)或可通過PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。這與我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，電針調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)分子活性，從而促進(jìn)改善IR大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。然而CSF組大鼠在經(jīng)過電針治療后，下丘腦GSK-3α與GSK-3β蛋白表達(dá)增加的同時(shí)，Aβ42與p-Tau陽性表達(dá)聚集數(shù)量減少、著色淺，且外周血FPG、 FINS及IRI水平降低?？紤]PI3K/Akt信號(hào)通路不是參與針灸防治IR認(rèn)知功能損害的唯一途徑，因此電針防治胰島素抵抗相關(guān)認(rèn)知功能損傷的作用機(jī)制值得更進(jìn)一步的研究。