基于線粒體途徑探索馬蘭草臍灸促肝纖維化模型大鼠活化肝星狀細胞凋亡機制研究*

李 嘉，高 玲，施楊婉玲，田源紅，楊孝芳，陳迎龍

(貴州中醫藥大學，貴陽 550025)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)以肝組織細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的過度增生和異常沉積為病理基礎，是各種慢性肝病導致的共同結果，其病因包括病毒感染、膽汁瘀積以及酒精和藥物損傷等，若不能進行有效治療，最終會導致肝衰竭、門脈高壓甚至危及生命[1]。研究表明，早期的HF是可逆的[2-3]，其中肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化是HF發生的細胞學基礎，目前許多藥物主要以誘導活化的HSCs凋亡作為防治HF的有效靶點[4]。馬蘭草作為貴州特色道地苗藥材，在民間常煎服用于治療傳染性肝炎、水腫、黃疸等，其性味辛、苦、寒，歸肺經、肝經、胃經、大腸經，有清熱解毒、散瘀止血消積之功。課題組前期研究初步發現，中藥口服辨證組方可改善肝硬化腹水大鼠線粒體能量代謝，馬蘭草臍灸對肝硬化腹水大鼠肝功能、線粒體有影響作用[5]。故本研究擬將馬蘭草絨制作為灸材，通過灸臍干預來觀察HF大鼠肝組織結構的病理改變與相關因子的表達變化。本實驗已通過貴州中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性Wistar大鼠40只，體質量(180±220) g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心實驗室提供，實驗動物許可證號SCXK(粵)2016-0020。

1.2 藥物及制備

苯巴比妥片(國藥準字H31022038)，上海信宜藥廠有限公司；秋水仙堿片(國藥準字H53021369)，西雙版納藥業有限公司。課題組前期選取貴陽市花溪區干燥的馬蘭草藥材，剪碎并精密稱取100 g加蒸餾水1000 mL，精密吸取馬蘭草揮發油0.025 mL制備供試品溶液，并進行色譜條件與方法學考察對藥材粉碎粒度的燃燒時間、速率進行考察及燃燒及煙霧量的測定，最終確定馬蘭草絨的制備工藝：將馬蘭全草粉碎過40目藥篩即得。本研究將適量馬蘭全草灸絨制作為灸柱置于大鼠臍處施灸。

1.3 試劑及儀器

CCl4(分析純,批號2008121)，江蘇強盛化工有限公司；橄欖油(批號LB-10-100627005344)，隴南市祥宇油橄欖開發有限責任公司；多聚甲醛(P0099)、山羊血清(批號C0265)、DAPI(批號C1005)、TritonX-100(批號ST795)、抗熒光淬滅劑(批號P0126)，上海碧云天生物技術有限公司；Bax一抗(批號Ab32503)，英國Abcam公司；Bcl-2一抗(批號Ab32124)，英國Abcam公司；COX活性檢測試劑盒(批號HL10014.3.1)，上海哈靈生物科技有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(批號KGA1045)，南京凱基生物科技發展有限公司；BCA試劑盒(批號20181015)，中日合資Solarbio公司。

Precisa12 A型電子分析天平(瑞士公司，BSA224S，萬分之一)；DHG-9240 A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫療器械廠)；Mini PROTEAN Tetra Cell型垂直電泳儀(美國Bio-Rad)；CFX96型熒光定量儀(美國Bio-Rad公司)；CKK53型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；TCS-SP8型激光共聚焦成像系統(德國Leica公司)；HB-RO/60型超純水儀(美國Millipore公司)；RM2235、HI1210和HI1220型切片機、展片機和烤片機(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 動物分組及建模

所有大鼠實驗室適應性喂養1周后，按隨機數字表法分成空白組、模型組、馬蘭草臍灸組、秋水仙堿組4組各10只。各組同期造模，實驗第1天除空白組大鼠外，其余各組大鼠均皮下注射40% CCl4橄欖油，注射劑量5.0 mL/kg(注射劑量/大鼠體質量)，以后每周3次皮下注射40% CCl4橄欖油，注射劑量3.0 mL/kg (注射劑量/大鼠體質量)，連續8周直至動物處死前1 d。

2.2 干預方法

空白組正常喂食喂水,抓取大鼠放入自制大鼠固定器仰臥位固定，固定時間同馬蘭草灸組大鼠施灸時間，連續干預8周直至動物處死前1 d。模型組抓取大鼠放入自制大鼠固定器仰臥位固定，固定時間同馬蘭草灸組大鼠施灸時間，連續干預8周直至動物處死前1 d。馬蘭草臍灸組：馬蘭草灸神闕穴，每次每穴3壯。大鼠神闕取穴按照《實驗針灸學》[6]并結合人體穴位的模擬位置取穴。穴位位于大鼠胸腹正中線，胸骨柄上緣至外生殖器連線的上3/4及下1/4交界處。穴位選定后剪毛，施灸時涂凡士林以保護小鼠皮膚且便于固定艾炷。馬蘭草灸炷做得緊而結實(底座直徑2 mm，高度5 mm，質量3～15 mg)，用線香點燃，每壯時間為18～20 s，當小鼠掙扎時更換，每次3壯，連續干預8周直至動物處死前1 d。秋水仙堿組(將秋水仙堿藥片磨碎,制成水溶液,每1 mL水中含0.1 mg秋水仙堿)5.0 mL/kg(秋水仙堿含量/大鼠體質量)灌胃,每日1次,首次造模次日開始給藥，藥物濃度及等效劑量按體質量折算，連續干預8周直至動物處死前1 d。

2.3 取血及取材

自首次造模開始計算日期，于第8周末當晚大鼠禁食不禁水12 h，次日上午最后1次稱取體質量后，用10%水合氯酸3.0 mL/kg大鼠體質量腹腔注射麻醉，手術臺固定大鼠，用手術剪刀打開腹腔，真空采血管腹主動脈取血保存，做離心取血清準備工作。提取肝臟(全部6片肝葉)4 ℃生理鹽水沖洗，去除薄膜和殘留組織,稱肝臟質量,每組各取3只大鼠肝臟全部浸泡于10%中性福爾馬林做肝臟外觀觀察使用，剩余全部肝臟用錫紙包裹標記后裝入布袋中，放入液氮保存備檢其他指標。每組大鼠隨即挑選3只，于肝右葉離邊緣1 cm處切取1塊肝組織(0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)，10%中性福爾馬林固定，做石蠟切片準備。所釆血樣4 ℃靜置2 h后，3000 rpm離心10 min分離血清，舍棄出現溶血現象的血清，其余分裝EP管，放入液氮保存備檢其他指標。

2.4 指標檢測

2.4.1 觀察大鼠外觀情況及肝臟大體形態 每日觀察大鼠生長、進食、進水、毛色、糞便、活動、死亡情況，觀察肝臟大體形態如體積、色澤、切口等。

2.4.2 血清肝功能指標測定 采集門靜脈采血2 ml，將血樣進行低溫離心分離，取上清液，用全自動生化儀檢測谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、白蛋白(ALB)。

2.4.3 肝組織蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE) 石蠟切片行HE染色，按照常規方法脫離、染色、透明和封固，鏡下觀察組織形態。

2.4.4 肝組織羥脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)含量和細胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase, COX)活性測定 冰凍肝組織用于檢測Hyp含量，根據Hyp測試盒的說明書操作。另取新鮮肝組織用電動勻漿器制備勻漿液,勻漿液緩沖成分(mmol/l)蔗糖250，Tris-Hcl5、EDTA1、PH值7.4。將勻漿液離心2000 g/10 min棄沉淀收集上清,重復離心收集上清,再離心12000 g/15 min，收集沉淀即得線粒體。取10ul制備好的線粒體懸浮液，將含亞鐵細胞色素C的反應底物加入，使亞鐵細胞色素C氧化成高鐵細胞色素C，按試劑盒介紹步驟使用分光光度法進行測定。

2.4.5 免疫印跡法(western blotting,WB)檢測肝組織中B細胞淋巴瘤-2 (b-cell lymphoma-2, Bcl-2)、相關X蛋白(bcl-2 associated x protein, Bax)蛋白表達 蛋白裂解測定濃度，加樣60μg蛋白緩沖，沸水浴5 min，配置10%分離膠和5%的濃縮膠，上樣電泳分離，轉移至PVDF膜。封閉1 h，加入稀釋一抗(TBST溶解的5%BSA)(兔抗Bax單克隆一抗1∶2000，兔抗Bcl-2單克隆一抗1∶1000)，4 ℃過夜;TBST洗3次，每次5 min;加入稀釋二抗(TBST溶解5%脫脂牛奶)(HRP山羊抗兔IgG二抗1∶10000)，室溫下孵育30 min，TBST洗3次，每次5 min，采用ECL法顯影曝光。

2.4.6 免疫熒光檢測肝組織中Bcl-2、Bax蛋白表達 蒸餾水清洗后浸泡PBS 5 min，組織切片滴加0.5% TritonX-100室溫打孔60 min，PBS漂洗3 min×3次，加入5%正常山羊血清封閉1 h，加入一抗(1∶200)濕盒4 ℃孵育過夜，室溫孵育1 h，PBS漂洗3 min×3次，加入熒光二抗(1∶300)濕盒37 ℃孵育1 h。于暗處濕盒37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3 min×3次，加入一抗(1∶200)濕盒37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3 min×3次，加入熒光二抗488(1∶300)濕盒37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3 min×3次，滴加DAPI避光孵育15 min，PBS 5 min×4次，洗去多余的DAPI，于激光掃描聚焦顯微鏡下(200X)觀察采集圖像。

2.4.7 dUTP缺口末端標記方法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,Tunel)-α-平滑肌動蛋白(smooth muscle actin, α-SMA)熒光雙染檢測活化HSCs凋亡情況 爬片PBS漂洗3 min×3次后吸干，6%山羊血清封閉30 min，分別滴加1∶100稀釋的Anti α-SMA于濕盒4 ℃孵育過夜。37 ℃復溫45 min，滴加1∶300的熒光二抗Anti488，濕盒室溫孵育1 h，加0.01 M TBS 1∶200 新鮮稀釋Proteinase K 37 ℃消化15 min。按每張切片取TdT和DIG-d-UTP各1 μL，加入18 μL標記緩沖液中混勻，甩去切片上多余液體后加20 μL/片標記液，置樣品于濕盒中，37 ℃標記2 h，0.01 M TBS 洗2 min×3 次。封閉液50 μL/片，室溫30 min后甩掉封閉液，用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體：(取1 ml抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10 μL)，混勻后50 μL/片加至標本片上。置樣品于濕盒中，37 ℃反應30 min，抗體稀釋液1∶100稀釋SABC-CY3，37 ℃反應30 min，滴加DAPI避光孵育3 min，核染，浸洗3 min×3次后封片，于激光掃描聚焦顯微鏡下(200X)觀察采集圖像。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 大鼠一般情況及肝臟大體形態

空白組大鼠活躍，進食飲水正常，毛色光亮潤澤，反應靈敏，體質量正常均勻，無動物死亡，大便成顆粒狀。模型組反應遲鈍，造模后進食量和飲水減少，毛色晦暗、蓬松，體質量降低，活動受阻，糞便常見拉稀，無動物死亡；馬蘭草臍灸組和秋水仙堿組各指標均有明顯好轉。

圖1示，空白組大鼠肝臟呈紫紅色，質地柔軟潤澤；模型組肝臟呈鮮紅色，質地干硬；馬蘭草臍灸組肝臟呈深褐色較潤澤；秋水仙堿組呈半紫紅半深褐色較潤澤。

圖1 大鼠肝臟大體形態比較

3.2 血清肝功能指標檢測

表1示，與空白組大鼠比較，模型組大鼠血清ALT、AST水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，馬蘭草臍灸組和秋水仙堿組ALT、AST水平均明顯降低(P<0.05)，各組ALB水平變化均不明顯(P<0.05)。

表1 血清肝功能指標檢測比較

3.3 HF大鼠肝組織病理形態學觀察

圖2示，空白組肝臟HE染色結構完整清晰，細胞大小均勻，無變形壞死，細胞核明顯；模型組可見大量炎癥細胞浸潤，肝細胞向脂肪變性；馬蘭草臍灸組可見炎性細胞減少，變性的脂肪細胞逐漸恢復；秋水仙堿組與馬蘭草臍灸組相似，可見脂肪細胞變性減少，有少量炎癥細胞。

注：空白組;模型組;馬蘭草臍灸組;秋水仙堿組圖2 HF大鼠肝組織HE染色(DAB×200)

3.4 肝組織中Hpy含量、線粒體COX活性測定

表2示，與空白組比較，模型組大鼠肝組織Hyp含量和COX水平均顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，馬蘭草臍灸組和秋水仙堿組大鼠肝組織Hyp含量和COX水平均有顯著下降(P<0.05)。

表2 Hpy含量、線粒體COX活性比較

3.5 Western Blotting檢測大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達

圖3圖4示，與空白組比較，模型組的Bcl-2有顯著上升(P<0.05)，Bax表達顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，馬蘭草臍灸組的Bcl-2表達有顯著下降(P<0.05)，Bax表達顯著上升(P<0.05)，秋水仙堿組的Bcl-2、Bax蛋白表達均有所上升(P<0.05)。

圖3 Western Blotting檢測大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達比較

注:與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05。圖4 Western Blotting檢測大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達量

3.6 免疫熒光檢測大鼠肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達

圖5示，綠色熒光為Bcl-2、Bax陽性細胞，廣泛表達于胞漿。結果顯示，與空白組比較，模型組Bcl-2表達顯著增多，Bax表達量減少且熒光不顯著；與模型組比較，馬蘭草臍灸組Bcl-2表達顯著減少且熒光顯著減弱，Bax表達顯著增多，秋水仙堿組的Bcl-2、Bax表達量均顯著增多且熒光顯著增強。

圖5 免疫熒光檢測大鼠肝組織BCL-2、BAX蛋白表達比較(DAB×200)

3.7 Tunel-α-SMA熒光雙染檢測肝組織中活化的HSCs

圖6示，綠色熒光為α-SMA陽性細胞，紅色熒光為tunel陽性細胞，玫紅色熒光為Tunel-α-SMA熒光雙染陽性細胞并代表已凋亡的活化HSCs。結果顯示，空白組無Tunel陽性細胞，有少量且不顯著α-SMA陽性細胞；模型組有少量且不顯著的Tunel陽性細胞，有大量且顯著的α-SMA陽性細胞；與模型組比較，馬蘭草臍灸和秋水仙堿干預后的大鼠肝組織中α-SMA陽性細胞明顯減少，熒光明顯減弱，Tunel陽性細胞明顯增多。

圖6 Tunel-α-SMA熒光雙染檢測肝組織中活化的HSCs(DAB×200)

4 討論

HF是由不同病因(乙肝、丙肝、酒精、藥物等)所致的慢性創傷愈合反應，并由多種細胞因子、ECM等相互作用形成。其中靜止的HSCs活化轉變為肌成纖維細胞(myofibroblasts, MFB)的過程是關鍵步驟[7]。目前主要抗HF的藥物是以抑制HSCs活化、誘導活化的HSCs凋亡，從而促進基質降解為治療靶向。中醫藥抗HF的研究備受關注，根據中藥多層次、多途徑、多靶點、多環節的作用特點，其分子機制的現代研究主要從抑制HSCs活化、誘導活化的HSCs凋亡、調節膠原代謝等幾個方面著手[8]。有數據證實，槲皮素通過線粒體途徑和內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)直接激活人類前列腺癌細胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶級聯反應(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)誘導凋亡[9]。本實驗研究馬蘭草絨灸臍通過線粒體細胞凋亡途徑促使活化的HSCs凋亡，減少ECM沉積，使HF逆轉。

線粒體細胞凋亡途徑是以細胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)的釋放為起始信號，通過Bcl-2家族蛋白的內源性線粒體通路觸發Csapase級聯反應的不可逆凋亡為特點[9]。Cyt-C是呼吸鏈的電子載體，與細胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)共價結合定位于線粒體內膜，Cyt-C在呼吸鏈電子傳遞過程中作為COX的電子供體，促成COX還原氧分子為水，線粒體COX活性與線粒體功能成正相關[10-12]。本研究結果提示，馬蘭草灸臍可以抑制CCl4誘導的HF大鼠肝線粒體COX活性，減少ATP合成，促進活化的HSCs凋亡。另外，Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax[13-14]，細胞存活與否二者表達量比例有關，Bcl-2通過穩定線粒體膜功能，阻止線粒體釋放Caspase、Cyt-C以及凋亡因子等[15]；Bax拮抗Bcl-2，兩者表達呈反比，當Bax大量表達時與Bcl-2蛋白形成異源二聚體加速細胞凋亡[16]。有研究顯示[17]，雙氫青蒿素可以增強促凋亡蛋白Bax的表達，同時削弱抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，導致Bax/Bcl-2比值升高，進而觸發線粒體凋亡通路。本研究顯示，馬蘭草臍灸組的促凋亡Bax蛋白有顯著上升，抗凋亡Bcl-2蛋白表達下降，提示馬蘭草臍灸組能更好地促進活化的HSCs凋亡，有效逆轉大鼠HF；同時免疫熒光結果與WB結果趨勢一致，馬蘭草臍灸可造成細胞形態改變、細胞融合、核碎裂等細胞凋亡趨勢。

正常肝臟的HSCs位于竇周間隙，形態不規則，其立體分布與延伸的胞突足以覆蓋整個肝竇微循環。α-SMA具有收縮性、原始炎癥性和高增殖性特點，靜止的HSCs合成膠原能力低，不表達α-SMA，而活化的HSCs則高表達α-SMA，因此，α-SMA表達已被用于識別肝組織是否含有MFB及HSCs是否處于活化狀態[18]。在HF病程高級階段，肝臟內ECM約為正常量的6倍，其中膠原是ECM的主要成分。有研究證實[19]，在CCl4誘導的HF小鼠中，芬銳替尼可呈劑量依賴性地減少肝中膠原沉積，對HF有一定的逆轉作用。本研究結果顯示，模型組α-SMA陽性細胞表達顯著，提示動物造模成功，馬蘭草臍灸組的Tunel-α-SMA陽性細胞表達顯著增加，提示馬蘭草臍灸干預可有效促進活化的HSCs凋亡，顯著逆轉HF。另外，以膠原為代表的肝臟ECM代謝失衡、生成大于降解是其生化學基礎[20]。Hyp是一種只存在于膠原中的氨基酸，是HF纖維膠原產生的主要來源，一定程度上反映纖維化肝組織中的膠原含量。活化的HSCs高表達Hyp。有研究顯示，CCAAT/增強子結合蛋白(CCAAT enhancer binding protein-α, C/EBP-α)，可降低CCl4誘導的HF小鼠的膠原蛋白和Hyp含量[21]。本研究結果顯示，馬蘭草臍灸可以更好地抑制HF進程，有效阻止肝細胞的結締組織形成。

HF根據其癥狀和體征屬于中醫學“黃疸”“脅痛”“積聚”“鼓脹”等范疇。據《臨證指南醫案》載：“病初始在氣,久必入血”和《張氏醫通·積聚》載：“正氣不足,而后邪氣踞之”，均認為正虛濕毒瘀阻是HF的主要病機。中醫治療HF遵循扶正祛邪的原則，常用攻、消、散、補四大法則來治療[22]。中醫臍灸療法又稱“神闕灸”，神闕穴聯系全身經脈，通過經氣的運行輸布，內至臟腑經絡，外達四肢百骸，五官九竅乃至皮毛。西醫認為臍在胚胎發育過程中為腹壁最后閉合處，無真皮層，滲透吸收力最強，諸多藥物均可通過臍快速進入體內而達全身[23]。前期研究中初步發現，馬蘭草臍灸能改善肝硬化腹水大鼠一般情況，引起腹水消退，并對肝線粒體具有一定影響。馬蘭草為菊科馬蘭的全草，其主要化學成分包括萜類、甾體、脂肪族、醌類、黃酮類等化合物，含有Cu、Se、Hg、Pb、Cd、As、Cr 等多種微量元素[24-25]。有研究顯示[26-27]，馬蘭草水煎液具有一定的預防和治療胃潰瘍的作用；另研究發現，乙酸乙酯部位(B)及水部位(D)可能為馬蘭抗實驗性胃潰瘍作用的主要藥效部位。本研究結果顯示，馬蘭草臍灸組大鼠肝臟表面呈深褐色較潤澤，ALT、AST水平明顯降低，同時可見脂肪細胞變性減少，提示馬蘭草臍灸可有效改善肝臟硬度，增加肝臟供血量，減緩肝細胞損傷程度。

綜上所述，馬蘭草臍灸以線粒體細胞凋亡通路為靶向誘導活化的HSCs凋亡，可能是其治療HF的機制之一。本文通過對其作用機制的研究，為馬蘭草臍灸治療HF提供了新的理論依據，并且為民族中醫藥的開發及臨床運用提供了實驗依據。