基于虛毒瘀病機理論探討細胞焦亡與肝癌關系*

張 振，曾普華，郜文輝，田雪飛△，田 莎，吳若霞，黃曉蒂，鄭 飄，黃 振，郭垠梅

(1.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，長沙 410208； 2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長沙 410006； 3.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，長沙 410208)

原發(fā)性肝癌(以下簡稱“肝癌”)是我國常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)2018年GOLOBAL CAN的統(tǒng)計，世界每年新增約84.1萬例肝癌患者，死亡約78.2萬例，嚴重威脅人民健康[1]。根據(jù)病理分型，肝癌可分為肝細胞肝癌(約占90%)、膽管細胞癌(約占 5%～10%)及混合型肝癌(約占5%～10%)[2]。目前，肝癌的研究多集中在細胞凋亡、自噬及血管新生等方面。近年來，隨著人們對肝癌發(fā)病機制研究的深入，細胞焦亡在肝癌發(fā)生發(fā)展及治療中的作用逐漸被揭示。

細胞焦亡是一種炎性相關性細胞程序性死亡方式，主要由半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)所介導。與細胞凋亡及壞死不同，細胞焦亡以胞膜穿孔、細胞腫脹破裂及大量炎性因子釋放為特征。有研究表明，細胞焦亡在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用[3]。本文擬從細胞焦亡角度，初步探討細胞焦亡與肝癌中醫(yī)病機聯(lián)系，為中西醫(yī)結合防治肝癌提供理論依據(jù)。

1 “虛、毒、瘀”是肝癌的主要病機

中醫(yī)對肝癌的認識及防治源遠流長。根據(jù)患者臨床癥狀及體征，肝癌屬于中醫(yī)學積聚、黃疽、鼓脹、肝水、脅痛等范疇。肝癌病因多樣，臨證繁多，病機復雜。肝癌患者常見納差、神疲、乏力、消瘦等“虛”證，其發(fā)展變化快、預后較差等，都屬于中醫(yī)“毒”或“癌毒”范疇。肝癌為有形之積，上腹腫塊、肝區(qū)固定疼痛是“瘀”的客觀表現(xiàn)。癌乃“因虛致癌”，先有正氣不足而后受外來邪毒侵襲，導致毒瘀互結而成，癌變進一步發(fā)展使正氣更虛，從而又表現(xiàn)出“因癌致虛”的現(xiàn)象，正虛、邪毒、血瘀三者始終并存，互為因果，惡性循環(huán)，貫穿于肝癌整個病程中。

氣是維持機體正常生命活動的運動不息的極細微物質(zhì)，在防御外邪入侵、維持臟腑功能正常運行等方面起著重要作用，也是機體免疫功能調(diào)節(jié)、物質(zhì)及能量代謝的具體體現(xiàn)。當人體正氣相對虛弱不足以抵抗外邪時，邪氣乘虛而入，導致臟腑氣血失調(diào)引發(fā)疾病。《外證醫(yī)案匯編》[4]有云：“正虛則為巖”?！侗静菥V目》[5]亦有云：“夫眾病積聚，皆起于虛也，虛生百病”，由此可見歷代醫(yī)家對惡性病病機的認識多以正虛為主。李晶等認為人體之氣具有識別異己的功能，腫瘤的發(fā)生與氣虛及其的功能失衡密切相關[6]。

肝癌的發(fā)生與癌毒密切相關[7]。肝癌發(fā)生的各階段癌毒所表現(xiàn)的形式不同：在癌前階段，癌毒是指能改變機體內(nèi)環(huán)境、引起原癌基因激活及抑癌基因抑制所有因素的總稱；在癌腫形成階段，癌毒是指促進癌細胞增殖的因素；肝癌后期，癌毒多是指以低氧、低PH值、高壓及大量炎性物質(zhì)等為特征的腫瘤微環(huán)境[8]。由此可見，癌毒既是特異性致病因子亦是病理產(chǎn)物。與火毒、濕毒、熱毒等相同，癌毒具有非物質(zhì)特征。癌毒的產(chǎn)生多與機體抗病能力下降、臟腑功能失調(diào)等有關。宋·楊士贏在《仁齋直指方論精要》[9]中說:“癌者，上高下深，巖穴之狀，顆顆累垂，毒根深藏，穿孔透里，男則多發(fā)于腹，女則多發(fā)于乳，或項或肩或臂，外癥令人昏迷。”認為癌疾源于“毒根深藏”，并且具有“穿孔透里”的特點，提示癌疾具有侵襲性與轉移性的特點。

肝藏血，主疏泄，調(diào)暢氣機，“體陰而用陽”。肝是保證機體血液正常運行的重要臟腑。肝氣郁結，行血不暢，血液停積，聚于局部而形成瘀血。《素問·舉痛論篇》：“血氣稽留不得行，故宿昔而成積矣”，即說明血瘀是積聚形成之病機?！鹅`樞·邪氣臟腑病形》有載：“有所墮墜，惡血留內(nèi)；若有所大怒，氣上而不下，積于脅下，則傷肝”，說明瘀血與肝臟關系密切。王清任《醫(yī)林改錯·膈下逐瘀湯所治之癥目》[10]：“無論何處，皆有氣血……氣無形不能結塊，結塊者，必有形之血也?！庇钟小岸歉菇Y塊，必有形之血凝聚”，說明氣滯血瘀是形成肝癌的必要條件，氣行不暢、經(jīng)脈不通而致肝癌發(fā)生。

簡言之，肝癌證屬于本虛標實，正氣虧虛是本，癌毒與瘀邪相互搏結、聚于局部發(fā)為腫塊為標。

2 細胞焦亡所產(chǎn)生各種炎性因子是肝癌“虛、毒、瘀”的微觀體現(xiàn)

細胞焦亡以調(diào)控炎性小體來實現(xiàn)。體內(nèi)外各種刺激，如細菌、病毒、藥物及衰老的細胞器、線粒體功能失衡等，均可誘導Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)的激活，NLRP3激活后，募集pro-Caspase-1及炎癥小體銜接子凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)形成炎性小體，并剪切pro-Caspase-1形成有活性的Caspase-1。Caspase-1一方面能刺激細胞產(chǎn)生IL-1β及IL-18的釋放，放大下游信號通路，增強局部炎癥反應；另一方面切割Gasdermin E(GSDME)產(chǎn)生GSDME-N端，促進細胞焦亡；同時使GSDME-N轉移至細胞膜，導致細胞裂解并釋放內(nèi)容物[11-14](如圖1)。

圖1 細胞焦亡機制

虛是以正氣不足為主要矛盾的病理反應[15]。肝癌是一種炎癥相關性疾病，約有90%的肝癌由慢性病毒性肝炎、脂肪肝等引起[16]。有研究表明，肝癌的發(fā)生與機體免疫失衡密切相關，肝癌患者血清輔助性T細胞(Th)1相關細胞因子水平下降，Th2相關細胞因子水平上升[17]。《素問·通評虛實論篇》有載：“邪氣盛則實，精氣奪則虛。”正常情況下，細胞焦亡過程中產(chǎn)生的各種炎性因子能清除癌細胞，促進癌細胞裂解死亡。肝癌患者血清中NLRP3含量低于正常組織，使得肝癌患者體內(nèi)細胞焦亡下游信號通路激活受限，無法及時清除癌細胞[18]。有研究表明[18]，與正常肝組織相比，肝癌組織中的NLRP3明顯降低，從而降低肝癌細胞焦亡。由此可知，體內(nèi)炎性因子缺乏能導致臟腑虛弱，抗病能力低下，無法抵御邪氣并導致肝癌的發(fā)生。

體內(nèi)各種引起腫瘤細胞增殖轉移的因素均屬于“癌毒”范疇。GSDME是抑癌基因P53的調(diào)控靶點，通常被認為是一種潛在的抑癌基因。GSDME的激活能抑制腫瘤細胞的增殖、遷移及浸潤[19]。肝癌組織中低表達狀態(tài)的GSDME，能促進細胞的增殖轉移[20]。IL-18屬于IL-1細胞因子超家族，是細胞焦亡的下游產(chǎn)物，能夠誘導T細胞合成干擾素 (IFN) -γ，增強Th1型免疫反應，促進腫瘤細胞死亡。與正常組織比較，肝癌組織中IL-18的表達明顯低于正常組織[21]，這些均提示細胞焦亡參與肝癌癌毒的形成。癌毒留于體內(nèi)久藏不去，日久耗傷人體正氣，使正氣更虛，正虛抗邪無力，則導致癌毒攻走流竄形成新的腫塊。

瘀是肝癌腫塊增長過程中所形成的必然產(chǎn)物，亦是病因。肝癌患者體內(nèi)血液處于高凝狀態(tài)[22]。血液高凝、血行不暢形成瘀血，瘀血聚于局部則發(fā)為肝癌。細胞焦亡過程中產(chǎn)生的IL-1β，能夠上調(diào)內(nèi)皮細胞及巨噬細胞上的內(nèi)皮細胞膜組織因子、環(huán)氧化酶及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，并下調(diào)血栓調(diào)節(jié)蛋白、內(nèi)皮細胞組織因子抑制物的表達，導致機體抗凝蛋白C系統(tǒng)的活性降低。此外，這些因子還能損害纖溶系統(tǒng)導致血栓形成。有學者認為，患者血流動力學改變及內(nèi)皮細胞功能損傷是瘀的微觀體現(xiàn)[23-24]。

由此可知，細胞焦亡異?？梢栽斐筛闻K功能紊亂、氣血代謝障礙形成血瘀，瘀毒相互搏結聚于肝部形成肝癌(如圖2)。

圖2 細胞焦亡與肝癌病機聯(lián)系

3 細胞焦亡參與肝癌的形成與發(fā)展

細胞焦亡在肝癌的形成和發(fā)展階段起雙向調(diào)節(jié)作用。肝癌癌前病變期，細胞焦亡水平上調(diào)產(chǎn)生的炎性小體及炎性因子能促進肝硬化向肝癌轉化；在肝癌形成以后，細胞焦亡水平下調(diào)，抑制肝癌細胞的裂解死亡，加速肝癌惡性程度[21]。

炎性小體的激活在細胞焦亡中起關鍵作用[25]。肝癌組織中，NLRP3炎性小體的表達顯著下調(diào)甚至缺失；且NLRP3炎性小體的表達與肝癌的病理分級和臨床分期呈負相關，這提示NLRP3炎性小體參與肝癌的發(fā)展[26]。激活的炎性小體將pro-Caspase-1剪切為有活性的Caspase-1。有研究表明，肝癌組織內(nèi)Caspase-1的表達明顯低于正常組織[27]。激活后的Caspase-1能刺激細胞產(chǎn)生IL-1β及IL-18。肝癌患者中細胞焦亡受到抑制，IL-1β及IL-18的表達水平低于正常人[21]。GSDME是焦亡下游產(chǎn)物之一。有學者比較了肝癌組織及正常組織中GSDME的表達，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中GSDME的表達較正常細胞低，且GSDME表達的增加可有效抑制HepG2細胞增殖[28]。

4 基于“虛、毒、瘀”病機及細胞焦亡微觀聯(lián)系探索中醫(yī)藥治療肝癌新策略

辨證是中醫(yī)認識疾病的基本原則之一。近年來，隨著細胞分子水平的發(fā)展，微觀辨證的概念應運而生[29]，并將傳統(tǒng)的辨證定義為宏觀辨證。

中醫(yī)藥治療肝癌具有多成分、多靶點、多通路的特點，且能夠控制瘤體，具有減毒增效的作用[30]。前期的基礎發(fā)現(xiàn)，肝癌的基本病機為“虛、毒、瘀”[7, 31]，采用益氣化瘀解毒法治療肝癌能提高患者半年、一年及兩年生存率，提高患者PFS[32]。益氣化瘀解毒中藥具有調(diào)節(jié)免疫、穩(wěn)定瘤體、下調(diào)VEGF表達、抗侵襲和轉移等作用[33]，同時益氣化瘀解毒中藥配伍能抑制人肝癌 HepG2細胞和裸鼠移植瘤的生長，下調(diào)HIF-1α、VEGF及VEGFR-2、MMP-2、MMP-9等表達，抑制肝癌血管新生，阻斷細胞自噬流，并且可能通過干預HIF-1α、Twist1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、E-cad、PI3K、mTOR等相關指標表達實現(xiàn)抗腫瘤作用[34-37]。

微觀辨證是利用現(xiàn)代信息技術，將細胞分子等現(xiàn)代生物信息知識引入中醫(yī)辨證體系。從中醫(yī)學角度出發(fā)，細胞焦亡是肝癌“虛、毒、瘀”的微觀體現(xiàn)，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。清熱解毒類藥物黃連的有效成分黃連素，能激活肝癌細胞炎性小體，上調(diào)Caspase-1的表達，促進細胞焦亡，抑制肝癌細胞的遷移和增殖[27]。因此，益氣化瘀解毒類中藥可能會通過影響細胞焦亡發(fā)揮抗肝癌作用。

在前期研究基礎上，本課題組將以益氣化瘀解毒為治法，從細胞焦亡及相關信號通路方面出發(fā)，進一步探究中醫(yī)藥治療肝癌的機制，為中西醫(yī)結合治療肝癌提供新的思路。