高速逆流色譜技術在中藥及天然產物中的應用研究*

彭詩濤，劉振麗，宋志前，王 淳，梁東蕊，萬曉瑩，宋 超，寧張弛△

(1. 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700；2. 首都醫科大學附屬北京佑安醫院藥學部，北京 100069)

中醫復方發揮治療作用與其藥效物質基礎密切相關，開展藥效物質基礎研究，對解釋方藥配伍規律、評估臨床療效具有重大意義[1]。中醫復方中包含中藥化學成分種類繁多、含量懸殊，給藥效物質基礎研究帶來了巨大的挑戰[2]，故采用必要的成分分離手段，是開展藥效物質基礎研究的途徑之一。高速逆流色譜(high-speed counter-current chromatography，HSCCC)是一種高效連續的液-液分配色譜技術，其利用互不相溶的兩相溶劑在螺旋管中高速行星式的運動，使分離物質在兩相之間多次分配，進而實現目標成分快速高效的分離及制備[3]。液體固定相相較于固體固定相克服了對成分的吸附和污染問題，有效避免了活性成分的分解與失活。同時，HSCCC技術的操作條件溫和、過程快速，具有成分不變性和無損失的優勢。

隨著科學技術的發展，早期HSCCC技術已難以滿足復雜成分分離的需求，技術創新出現在HSCCC應用的各個環節，如溶劑體系、洗脫方式、檢測技術以及與其他提取技術聯合應用等(圖 1)。這些技術革新為單體成分分離、化學組分分析及活性成分的發現提供了有力的技術支撐，從而拓展了HSCCC技術的應用空間，使得越來越多的中藥及天然產物組分得以分離、活性成分得以發現。為使該技術更好地應用于中醫復方藥效物質基礎研究，本文對相關領域的研究進行了歸納總結。

圖1 高速逆流色譜技術提升研究圖示

1 溶劑體系的改進

采用HSCCC技術對成分進行分離，首先要根據待分離成分的極性、溶解度等性質預選幾個溶劑體系，然后通過薄層色譜法、高效液相色譜法等測定成分在體系中的分配系數，從而確定最佳的溶劑體系[4]。早期HSCCC技術通常采用兩相溶劑體系，即將幾種試劑按一定比例混合后形成上下兩相；而后期三相溶劑體系的應用，實現了更多單體成分的分離。三相溶劑體系是由上、中、下三相組成，一般采用其中兩相作為流動相，第三相作為固定相，或采用其中的兩相分別作為固定相和流動相。

如Wu等[5]采用三相體系正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(4∶4∶3∶4，v/v/v/v)的上相/下相、上相/中相及中相/下相體系，成功分離了白芷、高良姜、知母中的水合氧化前胡素、白當歸素等17個成分。Ito等[6]采用正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(1∶1∶1∶1，v/v/v/v)的上、中、下三相，組合成不同的溶劑體系，實現了從色氨酸到β-胡蘿卜素的大跨度極性范圍標準物質分離。另有采用正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(1∶1∶1∶1，v/v/v/v)的中相為流動相，下相為固定相分離蘋果屬植物中的極性低聚物兒茶素的報道[7]。為建立不同極性維生素類成分的分離方法，通過以正己烷-甲基叔丁基醚-乙腈-水(5∶5∶7.5∶5，v/v/v/v)的上相為流動相、中相為固定相，實現了脂溶性維生素的分離；同時使用上述溶劑體系的下相為流動相、中相為固定相，分離得到水溶性維生素成分[8]。Yanagida等[9]運用正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(4∶4∶3∶4，v/v/v/v)三相體系，分離得到兒茶素、咖啡因等多個天然產物提取物的二級代謝產物成分。水黃皮中黃酮類化合物的分離以正己烷-乙腈-二氯甲烷-水(5∶5∶1∶5，v/v/v/v)體系中不同比例中相和下相混合溶劑(0.3∶0.7、0.1∶0.9，v/v)為固定相，上相為流動相，或以下相為固定相，上相為流動相實現[10]。報道顯示，三相溶劑體系正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(3∶6∶5∶5，v/v/v/v)可被用于蟾蜍二烯羥酸內酯的快速富集和分離[11]。Kamto等[12]通過調整固定溶劑體系中有機溶劑與水的比例，實現了鏈莢木屬植物中多種成分的分離。另有采用三相溶劑系統正己烷-乙酸乙酯-乙腈-水(7∶3∶5∶5，v/v/v/v)從鏈霉菌中提取大環酯類抗生素巴佛洛霉素A1的報道[13]。有學者比較了多種溶劑體系對乳香中乳香酸類成分的分離效果，發現三相溶劑體系正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(4∶4∶3∶4，v/v/v/v)的上中兩相，對于極性小且極性相近的乳香酸類成分的分離能力明顯優于兩相溶劑體系，最終分離得到18個乳香酸單體成分[14]。

此外，某些特殊試劑也在溶劑體系中起到特殊作用。如雙重手性選擇劑Cu(II)-1-丁基-3-甲基咪唑-[L-脯氨酸]與羥丙基-β-環糊精用于柚皮素的手性分離[15]。離子對試劑七氟丁酸的添加實現了千日紅中β-花青苷的分離[16]。

溶劑系統的選擇是采用HSCCC技術分離中藥及天然產物的核心步驟，同時也是難度最大的環節。Ito法、HBAW法和ARIZONA法是經典的多元溶劑體系的選擇方法，此外還有基于溶劑極性的分類選擇方法，但這些方法多針對兩相溶劑體系，在溶劑的選擇范圍方面還存在一定的局限性。近年來，三相溶劑的發明擴展了溶劑的選擇范圍，兼顧了更多化學成分的性質，大大節約了溶劑的使用量，對于多種化學成分的快速分離發揮了重大作用。特殊試劑的加入滿足了特殊化學基團成分的分離，但三相溶劑體系和特殊試劑的使用尚缺乏系統的理論指導。

2 洗脫方式的提升

中藥及天然產物中化學成分數量眾多，傳統的HSCCC技術多采用線性洗脫方式，但該方式對于結構相似成分的分離效果欠佳。學者們通過采用梯度洗脫、內循環洗脫以及兩步洗脫等溶劑泵洗脫改進方式，使HSCCC在成分分離中發揮了更大作用。

據報道，有學者通過對正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系比例和洗脫方式的改進，實現了葡萄屬中性質相近的二苯乙烯苷類低聚物的分離[17]。研究者通過改進線性洗脫和梯度洗脫的兩步洗脫方式，實現了芒果花中沒食子酸及櫚酸乙酯2個酚性成分的分離[18]。利用六通閥的切換使得洗脫時間和距離延長，可有利于海棠葉中多酚類成分的分離[19]。Song等[20]結合線性洗脫以及內循環2種洗脫方式，對番荔枝葉中的黃酮苷類成分進行了分離，以線性洗脫方式分離了分配系數相差較遠的成分，以內循環洗脫方式分離了分配系數相近的成分。

洗脫方式的技術提升，大大擴展了HSCCC技術在中藥及天然產物分離方面的應用。針對化合物本身的性質、結構特征以及多種化學成分之間的差異，學者們可以根據不同的分離需求靈活地對溶劑配比及洗脫時間進行設定。循環洗脫方式的出現，在延長洗脫時間的同時也大大節省了溶劑的使用，使得化學成分的分離實驗更加環保和綠色。

3 檢測技術的提升

早期HSCCC技術連接最多的是紫外檢測器，但該檢測器對吸收較弱或無紫外吸收的成分檢測效果微乎其微。后期質譜、傅立葉紅外光譜、蒸發光散射以及示差折光等檢測技術的聯合應用，拓展了HSCCC技術的使用范圍。同時，HSCCC技術與液相色譜分離技術的結合，進一步增強了對化學成分的分離與分析能力。

據報道，采用分析型HSCCC與液相色譜-質譜聯用技術，分離純化得到了木蝴蝶乙酸乙酯部位的鞣花酸和乙基棓酸[21]。HSCCC連接電噴霧質譜檢測器，通過搭建餾分收集器和檢測器之間的T型分流裝置，并根據進樣量選擇恰當的分流比，從茶葉中分離到原兒茶酸和黃酮苷類等多種多酚類化合物[22]。為實現甜青檸中微量成分的分離和分析，采用HSCCC和液相色譜-質譜聯用技術對目標成分進行分離與結構鑒定，從而大大提高了成分的檢測靈敏度[23]。HSCCC與液相色譜-質譜的聯用還被用于胡桃木中化學成分的分離和分析，該技術不僅可以實現成分的分離，還能夠實現結構鑒定與檢測成分純度[24]。

此外，HSCCC還有應用于成分的提取和敲除的相關報道，進而實現成分活性評價[25]。首先通過HSCCC-液相色譜-質譜聯用選取感興趣的化學信息，再采用HSCCC技術提取或敲除其余信息，最后對分離得到的化合物進行生物活性檢測。如采用離線的中心切割HSCCC與液相色譜-質譜聯用，線下借助1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)繪制出葡萄茶中具有抗氧化作用的成分輪廓圖，進一步分離得到15個具有抗氧化活性的黃酮類成分[26]。此外，還利用此方法發現了高良姜中具有抗氧化活性的成分[27]，并聯合HSCCC制備液相色譜從忍冬葉中分離出具有抗氧化活性的黃酮苷和咖啡酰奎寧酸[28]。杜仲葉[29]和中華卷柏[30]中抗氧化成分的研究也采用了同樣的思路。在超高效液相色譜與多級質譜聯用的基礎上，Zhao等[31]從芫花中分離得到具有抗艾滋病毒活性的瑞香烷二萜類成分。

與紫外檢測器不同，蒸發光散射等檢測器對成分具有破壞性，故以制備為目的HSCCC應用多連接T型分流裝置或采用線下連接的方式逐一對樣品進行檢測。由于抗氧化活性表征指標較為成熟，且操作簡單、具有較強的可行性，因此活性檢測器多以抗氧化檢測為主。Gong等[32]對HSCCC技術在天然抗氧化劑的分離方面進行了系統總結，HSCCC與抗氧化活性檢測器的聯合應用有望對天然抗氧化劑的挖掘與評價做出重要貢獻。聯合活性試驗的HSCCC技術也對新藥先導化合物的發現和篩選具有重要意義。其他活性檢測方式如果能夠找到適宜的表征指標，那么HSCCC在中藥及天然產物方面的研究將更有前景。

4 HSCCC與其他提取技術的聯合應用

中藥及天然產物成分復雜，天然活性物質研究面臨著分離效率低、活性成分流失的問題。近年來，有將新興提取技術與HSCCC聯用的相關報道，為提升活性成分的分離效率提供了參考。有學者采用CO2超臨界流體萃取法，首先將艾蒿中的茴蒿素分離，進一步采用HSCCC技術從艾蒿中分離京尼平苷酸[33]。針對目標成分的化學特性將提取分離方法有機地結合，通過響應面法進行優化，采用超聲波協助提取，并通過HSCCC技術對枸杞中的類胡蘿卜素成分進行分離[34]。液液精萃與HSCCC聯合技術被提出，并且在蒲公英和蓍草的成分提取和分離中得到應用[35]。Wang等[36]建立了水解提取-HSCCC法分離純化甘草中甘草素和甘草次酸的制備方法，甘草素和甘草次酸是甘草苷與甘草酸的水解產物，針對水解產物的分離和純化，將水解提取與HSCCC結合，大大擴展了HSCCC的分離范圍。

5 近年HSCCC技術在分離中藥及天然產物化學成分的應用

分離與制備中藥和天然產物的生物活性成分，是進行結構鑒定和藥理藥效學研究的基礎工作。HSCCC技術采用液液分配原理，避免了固體載體對成分的吸附和降解作用，被廣泛用于中藥及天然產物中黃酮、生物堿、木脂素、三萜和多酚類等化學成分的分離。對于黃酮苷類等較大極性成分，通常使用乙酸乙酯-水為基本組成的溶劑系統，如蓮、假澤蘭、葡萄籽中黃酮苷類成分的分離。生物堿類成分大多可以選用正己烷(石油醚)-乙酸乙酯-甲醇(乙醇)-水的溶劑體系。多數萜類成分極性較小，溶劑系統多采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、石油醚-乙醇-水，如乳香中乳香酸類成分、靈芝中靈芝酸的分離。針對多酚類成分，通常選用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的溶劑系統，如分離夜來香籽和柿中的沒食子酸。而對于聚合度高、分子量較大、羥基個數較多的多酚類成分，則采用正丁醇-水為基礎構成的溶劑體系，這類成分在紫外光下有較好的吸收，可采用紫外檢測器進行檢測。

正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶劑體系可以分離糖苷類、多酚類、苯丙素類以及羥基不飽和脂肪酸等成分。有學者采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.5∶5∶1.5∶5，v/v/v/v)從夜來香籽(OenotherabiennisL)中分離出沒食子酸、原花青素B3、兒茶酸和沒食子酸甲酯，這些成分被認為是有效的醛糖還原酶抑制劑，具有潛在的抑制糖尿病并發癥的作用[37]。Hu等[38]從闊葉十大功勞(Mahoniabealei(Fort.)Carr.)中分離出綠原酸、槲皮苷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖，并發現其具有抗氧化作用。正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶12∶1∶12，v/v/v/v)可從白芍(RadixPaeoniaeAlba)中提取出1,2,3,4,6-五沒食子酰基-β-D-葡萄糖，該單體可能通過MAPK和NF-κB途徑來減輕TNF-α介導的脂肪細胞炎癥[39]。Sun等[40]開發了一種HSCCC策略與在線存儲回收洗脫技術相結合的方法，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(9∶6∶6∶8，v/v/v/v)從苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)中分離出山豆根紫檀綜苷、苦豆酮等成分。Cen等[41]采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.5∶5∶1.5∶5，v/v/v/v)從南五味子(KadsuralongipedunculataFinet et Gagnep)中分離出槲皮素-3-O-鼠李糖苷和原兒茶酸，該方法快速、有效，是從中藥中篩選和分離潛在活性化合物的良好方法。金錢草具有解毒消腫的功效，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3.5∶5∶3.5∶5，v/v/v/v)可從金錢草(Sinopodophyllumemodi(Wall.)Ying)中分離出異戊烯基化雙黃酮B和異戊烯基化雙黃酮C[42]。Feng等[43]采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(7∶12∶11∶5，v/v/v/v)從靈芝(Ganodermalucidum)中分離出靈芝酸S、靈芝酸T、靈芝醛B，它們是靈芝中主要的生物活性三萜。采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶4∶2∶6，v/v/v/v)可從胡蘆巴(Trigonellafoenum-graecumL.)中大規模分離和純化大黃苷、丹葉大黃素[44]。黃花刺茄(Solanumrostratum)是一種對癌細胞具有毒性作用的植物，研究發現，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶7∶1∶7，v/v/v/v)可從其中分離出金絲桃苷、3’-O-甲基槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、紫云英苷、3′-O-甲基槲皮素-3-O-β-D葡萄糖苷等單體成分[45]。Shaheen等[18]采用己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶4∶6，v/v/v/v)和二氯甲烷-甲醇-水(4∶3∶2，v/v/v)兩步HSCCC法，對芒果花(Mangiferaindica.L)中沒食子酸、沒食子酸乙酯和鞣花酸進行了分離和純化。Yan等[46]利用超臨界CO2流體萃取從小米椒(CapsicumfrutescensL. (Solanaceae))中提取辣椒素和二氫辣椒素，并進一步采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.4∶0.6∶1.0∶1.0，v/v/v/v)對其進行純化，結果表明，該方法高效、實用，可大規模地實現小米椒中辣椒素和二氫辣椒素的高效制備。正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(10∶2∶5∶7，v/v/v/v)可從節鞭山姜(AlpiniaconchigeraGriff)中分離出6-姜辣素，該化合物在體外具有良好的抗氧化活性[47]。馬藺(IrislacteaPall. var. chinensis(Fisch.)Koidz)是一種鳶尾科植物，具有保肝、抗氧化、抗腫瘤的藥理活性，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶5∶3∶6， v/v/v/v)[48]可從馬藺中提取出Vitisin D，白蘞素B和Vitisin A反式異構體，這些單體可能具有潛在的藥效作用。馬桑根瘤菌(CoriarianepalensisWall,L.hammesii,L.plantarum)可以被正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶1.5∶3∶2，v/v/v/v)提取出具有良好抑菌作用的羥基不飽和脂肪酸[49]。Liu等[50]采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶2∶0.625，v/v/v/v)從永嘉早香柚(Citrus grandis(L.)Osbeck cv.)中分離出佛手柑素，該化合物首次被報道具有治療糖尿病的潛力。Wang等[51]采用2種不同比例的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶2∶5∶2、6∶1∶6∶1.2，v/v/v/v)，首次從杜仲(Eurycomalongifolia)中分離出longifolione A、longifolione B、longifolione C、longifolione D、longifolione E 5種化合物。此外，HSCCC還可用于霉菌中成分的分離。Sun等[52]采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(6.5∶3.5∶5∶5，v/v/v/v)從稻曲菌(Villosiclavavirens;UstilaginoideavirensTakahashi)中分離出稻曲菌素A、稻曲菌素G、稻曲菌素B、稻曲菌素H、稻曲菌素I、稻曲菌素C和稻曲菌素J，并對其結構做了進一步表征。正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.1%甲酸水(1∶5∶1∶5，v/v/v/v)可從紅曲霉(Monascus)中分離出黃單胞桿菌A和B[53]。2種不同比例的己烷類-乙酯-甲醇-水(6∶4∶5∶5、8.5∶1.5∶5∶5，v/v/v/v)，可從赤霉菌(Gibberella)中分離出桿孢菌素E、桿孢菌素E醋酸酯、疣孢菌素L醋酸酯、疣孢菌素J等成分，為相關標準物質研究提供了借鑒[54]。

石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水溶劑體系可以分離酚類、酯類、酸類以及生物堿類成分。有學者采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(0.8∶1∶1∶0.8，v/v/v/v)從高良姜(AlpiniaofficinarumHance)中分離出純化高良姜素和山奈酚，兩者均表現出顯著的抗氧化活性[27]。Guo等[55]采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(8∶4∶7∶5，v/v/v/v)從厚樸(MagnoliaofficinalisRehd. Et Wils.)中分離出和厚樸酚、厚樸酚、木蘭箭毒堿、木蘭花堿、毛蕊花糖苷等成分，為厚樸的質量控制與臨床應用研究提供了參考。除蟲菊(Chrysanthemum cineraraeflium)提取物被認為是天然的殺蟲劑，除蟲菊酯是其主要有效成分，石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(10∶2∶10∶2，v/v/v/v)是從除蟲菊中快速分離、純化除蟲菊酯的有效方法[56]。Cao等[57]采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶1∶6.5∶3.5，v/v/v/v)從木香(RadixAucklandiae)中分離出10α-甲氧基青蒿素酸、木香烯內酯、去氫木香內酯，并進一步對其結構進行了鑒定。石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶3∶0.5∶5，v/v/v/v)可用于菝葜(SmilaxchinaL.)中5-O-咖啡酰莽草酸、紫杉葉、新落新婦苷、落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷成分的分離制備[58]。此外，不同體積比的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水還可用于牛蒡根(ArctiumlappaL.)中1,5-O-1,5-二咖啡酰奎寧酸、3-O-咖啡酰奎寧酸甲酯和4,5-O-二咖啡酰奎寧酸等10種成分的分離制備[59]。石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶0.7∶1∶0.7，v/v/v/v)可實現爵床(Justicia procumbens L.)中爵床脂素A、爵床脂素B、6’-羥基爵床脂素C等10種成分的分離純化，且純度均在94%以上[60]。Li等[61]采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶3∶7，v/v/v/v)、 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(5∶5∶3∶7∶0.02、5∶5∶4.3∶5.7∶0.02，v/v/v/v/v)、乙酸乙酯-正丁醇-甲酸-水(4∶1∶0.5∶5，v/v/v/v)從臘梅花(Chimonanthuspraecox(Linn.)Link)中分離出3,4-二羥基苯甲酸、原兒茶醛、對香豆酸等8種化合物，并進一步對其結構進行了鑒定。刺五加(AcanthopanaxSessiliflorus(Rupr. & Maxim.)Seem)是五加屬最豐富的物種之一。研究者采用甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸(3.5∶0.5∶1.5∶0.01，v/v/v/v)從刺五加中分離出矢車菊素3-木糖基半乳糖苷，并表明其具有顯著的抗氧化作用[62]。丹參(SalviaMiltiorrhizaBunge)是臨床常用的活血化瘀藥物，Yang等[63]采用甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水(3∶1∶1∶20，v/v/v/v)從丹參中分離出蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-α-鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖和芹黃素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖，其中蘆丁和異槲皮苷具有較強的抗氧化能力。氯仿-二氯甲烷-甲醇-水(4∶2∶3∶2，v/v/v/v)可從猴頭菇菌(Hericium erinaceum Mycelium)分離出染料木黃酮和黃豆苷元，表明HSCCC是從天然產物中高效分離和純化生物活性物質的有力工具[64]。Wu等[65]采用乙酸乙酯-正丁醇-水(1∶2∶3，v/v/v)從蓮(NelumbonuciferaGaertn.)中首次分離出槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖基-8-C-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、芹菜素-6,8-二-C-β-D-吡喃葡萄糖苷4種黃酮苷類成分，并對其結構進行了確認。Zhu等[66]采用乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶5∶1，v/v/v)從南美番荔枝葉(AnnonasquamosaLinn)中分離出槲皮素-3-O-洋槐糖苷、蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷，其中前三者在降血糖方面表現出良好的活性。己烷-乙酸乙酯-水(1∶50∶50，v/v/v)是從可可樹(Theobromacacao)[67]中分離二聚原花青素B2的有效方法。己烷-乙酸乙酯-水(1∶50∶50，v/v/v)和乙酸乙酯-水(1∶1，v/v)可葡萄籽(VitisviniferaL.)[68]中分離出17種原花青素成分，且每種成分均具有較高的收率和純度，表明HSCCC是一種高效、快捷的成分分離方法。

此外，不同組成及配比的其他溶劑系統還可對中藥及天然產物進行單體成分的分離。Wen等[69]采用氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，v/v/v/v)，從山楂葉(Crataeguspinnatifida)中分離出表兒茶素、金絲桃、異槲皮苷等7個成分，并進一步對其結構鑒定。Zhou等[70]采用乙酸乙酯-甲醇-正丁醇-水(9∶1∶0.5∶9，v/v/v/v)，從沙棘(HippophaerhamnoidesLinn)中分離出槐樟醇-7-O-{3-O-[2(E)-2,6-二甲基-6-羥基-2,7-辛二烯]}-α-L-鼠李糖苷和hippophanone 2種新化合物。Wang[71]等采用乙酸乙酯-甲醇-水(25∶1∶25，v/v/v)，從假澤蘭(Mikaniamicrantha)中分離出槲皮素-3-O-蕓香糖苷、木犀草苷、黃芩苷和黃芪素，結果表明磁納米顆粒-HSCCC在線分離系統高效、可回收，可用于從天然產物中極性相似黃酮類化合物的分離。Xu等[72]采用正丁醇-叔丁基甲基醚-乙腈-水-不飽和脂肪酸(2∶2∶1∶5∶0.01，v/v/v/v)，從草莓(FragariaananassaDuch.)中分離出花葵素-3-O-葡萄糖苷，該成分可以用作天然生物活性劑，以防止細胞氧化應激。研究報道，利用正己烷-乙醇-水等多種溶劑體系，從紅木樹皮(Ormocarpumkirkiibark)中分離出吡喃葡萄糖、柚皮素等14種極性不同的化合物，表明HSCCC分離成分無損失且溶劑用量少，是一種高效的天然產物分離方法[12]。Li等[73]采用氯仿-甲醇-水溶劑體系，從野菊花(DendranthemaindicumL.)中分離出金合歡素、芹菜素、木犀草素、蒙花苷等單體，進一步明確了野菊花抗骨質疏松作用的機制。醋乳香為乳香(Boswelliacarterii)經醋炙后所得的中藥飲片，研究者采用正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水(4∶4∶3∶4，v/v/v/v)從醋乳香中分離出α-乳香酸等18種成分[14]。有學者[74, 75]采用己烷-乙酸乙酯-水(1∶50∶50，v/v/v)從葡萄(VitisviniferaL.)中分離出兒茶素、表兒茶素、肉豆蔻酸、咖啡酸和原花青素等多種化合物，表明HSCCC與制備型HPLC聯用方便、高效，是分離葡萄中多酚類成分的有效策略。Kucab等[76]采用叔丁基甲基醚-丁醇-乙腈-水和等溶劑體系，從雞冠花(CelosiacristataL.)中分離出甜菜紅素，并對其中的β-花青素進行了首次測定。Liu等[77]采用乙酸乙酯-正丁醇-水(3∶2∶5，v/v/v)和正丁醇-水-甲醇-乙酸乙酯(1∶6∶0.5∶4，v/v/v/v)從秀山金銀花(Loniceramacranthoides)中分離出木通皂苷D等4種皂苷類成分，且這些成分均表現出良好的抗腫瘤活性。正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(5∶6∶5∶5，v/v/v/v)是絞股藍(Gynostemmapentaphyllum)中商陸苷有效的分離純化方法[78]。Marques等[79]采用正己醇-乙腈(1∶1，v/v)和正己烷-乙腈-乙酸乙酯(1∶1∶0.4，v/v/v)，從胡椒(Piperclaussenianum(Miq.)C.DC.(Piperaceae))中分離出橙花叔醇、芳樟醇等成分，表明HSCCC技術對于分離萜烯物質具有良好的應用價值。Chen等[80]采用乙酸乙酯-丁醇-水(2∶1∶3，v/v/v)和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶3∶1∶3，v/v/v/v)，從龍膽(GentianascabraBunge)中分離出番木鱉酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和三葉苷4種化合物，這些化合物均具有良好的抑制一氧化氮分泌作用。Cho等[81]采用乙酸乙酯-乙腈-水(1∶0.1∶1，v/v/v)，從白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)中分離出aceroside VIII和platyphylloside，并對癌細胞表現出劑量依賴性抑制作用，可能是癌癥的靶向治療劑。Geng等[82]采用丁醇-乙酸-水(4∶1∶5，v/v/v)從甘蔗(SaccharumsinensisRoxb.)中分離出對香豆酸、阿魏酸等單體，提高了天然產物的綜合利用價值。此外，利用乙酸乙酯-甲醇-水(25∶1∶25，v/v/v)可從大葉藤黃(Garciniaxanthochymus)中分離出大葉藤黃醇和guttiferone E，實現了異構體的良好分離[83]。Lu等[84]采用正己烷-正丁醇-水(3∶2∶5，v/v/v)從長果婆婆納(VeronicaciliataFisch.)中分離出木犀草素、4-羥基苯甲酸、3,4-二羥基苯甲酸等5種化合物，并研究表明其均具有良好的抗肝癌活性。Du等[85]采用正己醇-丙酮-乙醇-水(1∶1∶1∶1，v/v/v/v)首次從紅法夫酵母(Phaffiarhodozyma)中分離出蝦青素，并對其進行了結構確認。乙酸乙酯-丁醇-1.5% 水合氫氧化銨(1∶4∶5，v/v/v)可從冬蟲夏草(Cordycepsmilitaris)[86]中分離出3種核苷，且其純度均在98%以上。

通過對HSCCC在中藥及天然產物物質基礎研究應用的相關文獻進行分析，為中藥及天然產物物質基礎的溶解系統選擇和溶劑比例等方面提供了借鑒。HSCCC具有分離結果純凈、制備量較大、重現性好、操作簡便等優點，可用于高純度活性物質對照品的制備。

6 小結

中醫復方是中藥在臨床應用中的基本形式，開展中藥藥效物質基礎研究對于推動中醫藥現代化進程至關重要。中藥及天然產物的活性成分是新藥發現的重要來源[87]。隨著復方藥效物質基礎研究的推進，中藥復方藥效物質基礎雖未完全闡明，但在不同層面上都取得了一定進展。如若實現進一步的突破，更需思想與方法的多元化。HSCCC技術不僅可以分離得到單體成分，還可以實現全成分分段分離，發現活性部位甚至活性成分，這在一定程度上克服了中醫復方研究中藥效成分種類眾多、含量懸殊帶來的挑戰。近些年，基于溶劑體系、洗脫方式、檢測技術以及與其他分離技術聯用的創新研究，極大地推動了HSCCC技術的應用，具有十分重要的意義。

雖然HSCCC技術不斷進步，但其廣泛應用仍然受到制約。盡管有學者建立了經驗性的溶劑體系篩選方法[87]，但在實際應用中受到操作者個人經驗的影響。目前HSCCC技術雖已經實現了上百毫克級乃至數十克級成分的分離制備，但對于數百克級甚或公斤數量級的制備能力還有待提高。相信隨著科學技術的進步與發展，HSCCC技術將為中藥復方藥效物質基礎研究提供更加完備的技術支撐。