DNA納米結(jié)構(gòu)設(shè)計、合成及應(yīng)用研究進(jìn)展簡述

段金偉

(長安大學(xué) 理學(xué)院，陜西 西安 710064)

在原子尺度上操縱材料從而實(shí)現(xiàn)定制材料性能的可能性是化學(xué)和材料科學(xué)發(fā)展的重要目標(biāo)之一，然而時至今日這依舊是一個巨大的挑戰(zhàn).在過去的幾十年里，科學(xué)家們始終在尋找一些具有可控制且模塊化性質(zhì)的材料，希望能夠推動納米結(jié)構(gòu)領(lǐng)域的快速發(fā)展.不同于傳統(tǒng)的有機(jī)和無機(jī)材料，DNA具有良好的可尋址性、可控性、以及存在于DNA鏈之間的弱相互作用，使得DNA被認(rèn)為是合成納米材料的理想原材料之一[1-4].傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為DNA僅僅是攜帶遺傳信息的載體，但隨著紐約大學(xué)N.C.Seeman教授的發(fā)現(xiàn)，這一觀念徹底被顛覆.N.C.Seeman無意間發(fā)現(xiàn)能夠利用DNA黏性末端將設(shè)計好的分支結(jié)構(gòu)連接起來形成三維目標(biāo)結(jié)構(gòu)，于是在1991年首次人工合成了一個剛性的DNA立方體[5]，打開了DNA納米領(lǐng)域的研究大門[6-13].DNA納米技術(shù)是利用Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對的特異性和DNA自身的特殊性質(zhì)，以自組裝策略為基礎(chǔ)，以構(gòu)筑二維和三維方向上重復(fù)陣列為目標(biāo)的新穎的分子納米技術(shù)[1,14-15].

自Seeman提出以DNA為原材料合成納米結(jié)構(gòu)的設(shè)想后，科學(xué)家們先后開發(fā)了一系列幫助進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計的算法和軟件[16-23]，優(yōu)化、改進(jìn)并提出了多種新的合成方法[7,10,24-29]，并且嘗試將DNA納米結(jié)構(gòu)應(yīng)用到藥物運(yùn)輸、疾病診斷和治療、熒光成像等領(lǐng)域[30-37].

1 DNA結(jié)構(gòu)設(shè)計軟件

為了實(shí)現(xiàn)精確操作原子,達(dá)到合成目標(biāo)DNA納米結(jié)構(gòu)的目的，需要根據(jù)目標(biāo)結(jié)構(gòu)來進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計，這個過程不僅需要耗費(fèi)大量的人力和物力，而且耗時極長.早期的DNA納米結(jié)構(gòu)設(shè)計軟件使用的是pdb、mol等標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)構(gòu)文件的現(xiàn)有分子建模工具[38].這些工具允許設(shè)計者在原子級別上對DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行修改或修飾，結(jié)構(gòu)建模大多是在序列層面上手動完成的.然而，這些程序設(shè)計過程中缺乏結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，限制了設(shè)計和操作多層三維結(jié)構(gòu)的能力.而三維 DNA納米結(jié)構(gòu)的開發(fā)，需要大量的手工計算和熟練使用通用建模工具[38].

DNA納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建通常包括一條長鏈的路徑(大約8 000個核苷酸)，釘書針的放置和序列的確定，對于大型納米結(jié)構(gòu)來說是一項挑戰(zhàn)性任務(wù).在功能化需求日益增高和結(jié)構(gòu)設(shè)計復(fù)雜性逐漸提升的驅(qū)動下，為了促進(jìn)新的DNA納米結(jié)構(gòu)發(fā)展，并讓用戶更加直觀地了解DNA折疊的復(fù)雜性，科學(xué)家們基于不同用途開發(fā)了一系列建模工具和可視化程序，主要包括：Tiamat[38]，CaDNAno[17]，vHelix[39]，NUPACK[40]，ATHENA[41]，Adentia[23]和MrDNA[22]等.DNA結(jié)構(gòu)設(shè)計軟件的界面對使用者越來越友好，功能也越來越強(qiáng)大，極大地降低了結(jié)構(gòu)設(shè)計過程的成本.在降低定制DNA分子的生產(chǎn)成本和提升結(jié)構(gòu)操縱的可能性方面取得了重大進(jìn)展.本文中，選擇性地介紹其中比較常用的4款軟件.

1.1 CaDNAno

CaDNAno是Douglas等人2009年開發(fā)的一款支持利用DNA折紙技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計的開源軟件包，配套安裝Python或Autodesk Maya運(yùn)行，其官網(wǎng)地址為http://cadnano.org/.CaDNAno簡化和增強(qiáng)了設(shè)計三維DNA折紙納米結(jié)構(gòu)的過程.通過用戶友好的2D和3D界面，可以使設(shè)計者根據(jù)自己的需求進(jìn)行任意設(shè)計創(chuàng)建.CaDNAno的嵌入規(guī)則與CanDo執(zhí)行的有限元分析相結(jié)合，提高了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的相對確定性.

CaDNAno是一個被廣泛使用的軟件，可用來幫助設(shè)計基于晶格的DNA納米結(jié)構(gòu).該軟件將設(shè)計的截面分為兩種格子類型，即正方形和蜂窩，確保了設(shè)計的高度可靠性.這種截面類型可以確保交叉的適當(dāng)位置，因此在體外DNA納米結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)高折疊性.如圖1所示，CaDNAno的建模過程包括六個主要步驟：①通過填充晶格上的空位置來定義納米結(jié)構(gòu)的平面形狀，Honeycomb(蜂窩狀)或Square(方形)二選一(圖1a).②根據(jù)需要定義了單個螺旋的長度(圖1c).③構(gòu)建一個DNAorigami骨架鏈穿過納米結(jié)構(gòu)的二維圖(圖1d).④骨架鏈設(shè)計完成后，電極“AutoStaple”自動生成與骨架鏈綁定的訂書針鏈(圖1e).⑤點(diǎn)擊訂書針鏈根據(jù)用戶需要調(diào)整其長度、連接和斷開方式(圖1e).⑥點(diǎn)擊“Seq”按鈕選擇合適的骨架鏈類型，通常用M13mp18，確定骨架鏈和訂書針鏈的DNA序列(圖1b).⑦利用CaDNAno以.json文件格式導(dǎo)出DNA納米結(jié)構(gòu)的模型，以.csv格式導(dǎo)出DNA序列，以.svg格式導(dǎo)出示意圖(圖1f).

圖1 CaDNAno設(shè)計DNA納米結(jié)構(gòu)示意圖[17]

1.2 NUPACK

NUPACK是一個不斷發(fā)展的DNA納米結(jié)構(gòu)序列設(shè)計在線分析軟件，其官網(wǎng)為http://nupack.org/，主要用于核酸結(jié)構(gòu)、設(shè)備和系統(tǒng)的分析和設(shè)計，使用nupack.org上的NUPACK web應(yīng)用程序可以便捷地運(yùn)行該軟件的大部分功能.NUPACK web應(yīng)用程序可以分析和設(shè)計一個或多個相互作用的核酸鏈的平衡堿基對的特性.主要功能包括分析、設(shè)計、用途.①分析:在稀溶液狀態(tài)下，對核酸鏈的相互作用進(jìn)行熱力學(xué)分析.②設(shè)計:在平衡時，對目標(biāo)二級結(jié)構(gòu)的核酸鏈復(fù)合物的序列進(jìn)行設(shè)計.③用途:對一組核酸鏈的平衡特性進(jìn)行評估、顯示和注釋.

圖2 NUPACK web應(yīng)用程序操作界面[40]

1.3 Adentia

Adenita是一個交互式的3D設(shè)計軟件，是作為SAMSON Connect(SAMSON Connect是一個3D建模圖形框架)的一個開源插件開發(fā)的.Adenita提供半手動和高度模塊化的設(shè)計方法，允許用戶同時使用所有常見的DNA架構(gòu)來減少早期DNA-origami軟件解決方案的建模限制.Adenita通過調(diào)整模型的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，實(shí)現(xiàn)模型的多尺度、適應(yīng)性可視化,以適應(yīng)當(dāng)前設(shè)計目標(biāo)[47]的需求.因此，可以在一個抽象圖形或網(wǎng)格上設(shè)計大型的納米結(jié)構(gòu).一個有經(jīng)驗(yàn)的用戶可以通過Adenita平臺將所有現(xiàn)有設(shè)計結(jié)構(gòu)整合到一個構(gòu)型中，例如：腺嘌呤有助于有機(jī)和無機(jī)分子(包括蛋白質(zhì))的整合，可以被直接整合到DNA納米結(jié)構(gòu)中.Adenita平臺可以簡化納米結(jié)構(gòu)的功能化設(shè)計過程，賦予并提升用戶研究和調(diào)節(jié)各種功能元素之間相互作用的能力.

圖3 Adenita設(shè)計DNA納米結(jié)構(gòu)示意圖[23]

1.4 MrDNA

雖然DNA結(jié)構(gòu)納米技術(shù)以驚人的速度發(fā)展，但從頭設(shè)計復(fù)雜的3D納米結(jié)構(gòu)和功能器件仍然是一個費(fèi)力且耗時的過程.其中一個原因是需要多次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)表征，以闡明設(shè)計選擇對自組裝物體實(shí)際形狀和功能的影響.Aleksei Aksimentiev等人開發(fā)的MrDNA(圖4)，是一個基于Python開發(fā)的多分辨率的模擬框架，可以由社區(qū)進(jìn)行擴(kuò)展，并與DNA設(shè)計和分子圖形工具集成的工具.MrDNA在30分鐘或更短的時間內(nèi)，可以構(gòu)建一個自組裝DNA納米系統(tǒng)的原子分辨率結(jié)構(gòu).

圖4 MrDNA設(shè)計并合成DNA納米結(jié)構(gòu)示意圖[22]

除此之外，其他的DNA納米結(jié)構(gòu)的在線設(shè)計及分析平臺還包括，如Daedalus(http://daedalus-dna-origami.org/)[42]，Perdix(http://perdix-dna-origami.org/)[20]，TALOS(http://talos-dna-origami.org/)[19]，METIS(https://metis-dna-origami.org/)[18]，scadnano(https://scadnano.org/)[43]和TacoxDNA(http://tacoxdna.sissa.it/)[21]等，需要根據(jù)目標(biāo)DNA納米結(jié)構(gòu)的不同，選擇合適的設(shè)計軟件.

2 DNA納米結(jié)構(gòu)合成方法

為了實(shí)現(xiàn)更精細(xì)的控制和合成更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，科學(xué)家們先后提出了幾種不同的組裝方法，主要包括DNA tiles(瓦片)法[44]、DNAorigami(折紙)法[10]和DNAbricks(磚)法[45-46].

2.1 DNA瓦片法

基于堿基互補(bǔ)配對原則，DNA單鏈可以通過弱的作用力配對形成一定數(shù)目DNA雙螺旋片段并列的瓦片結(jié)構(gòu)，通常稱為tiles或motifs.利用DNA瓦片裸露出來的黏性末端(圖5a)，可以將一定數(shù)量的DNA瓦片鏈接起來，形成從一維到三維的納米結(jié)構(gòu).常見的瓦片結(jié)構(gòu)包括：n-分支結(jié)構(gòu)、DX-tile、星狀結(jié)構(gòu)模塊等.

2.1.1n-分支結(jié)構(gòu)(n-arm junction)

紐約大學(xué)Seeman教授受基因重組Holliday中間體的啟發(fā)(如圖5b所示)，認(rèn)為可以利用帶有黏性末端的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)合成DNA分支結(jié)構(gòu).1983年，Seeman等人成功合成了DNA的四分支(four-armjunction)結(jié)構(gòu)[47](如圖5c所示).DNA四分支結(jié)構(gòu)由四條DNA單鏈通過不完全互補(bǔ)配對構(gòu)成，是每條DNA單鏈與相鄰的兩條單鏈部分結(jié)合形成的.DNA四分支結(jié)構(gòu)與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)相比表現(xiàn)出更高的結(jié)構(gòu)剛性，而且每個DNA四分支結(jié)構(gòu)都有四個未配對的DNA黏性末端.這種黏性末端有可能利用DNA四分支結(jié)構(gòu)進(jìn)一步通過堿基互補(bǔ)配對構(gòu)成更大規(guī)模的網(wǎng)格(圖5c)，可滿足作為構(gòu)建三維周期網(wǎng)絡(luò)的基本構(gòu)件的基本要求[48].隨后，科學(xué)家們在實(shí)驗(yàn)室合成了一系列的n-分支結(jié)構(gòu)，如5-分支結(jié)構(gòu)[49]、6-分支結(jié)構(gòu)[49]、8-分支結(jié)構(gòu)[50]、12-分支結(jié)構(gòu)等[50]，但這些簡單的結(jié)構(gòu)靈活性較大，不利于相互連接得到更大的結(jié)構(gòu)[51-52].

圖5 n-分支結(jié)構(gòu)示意圖[22]

2.1.2 DX-tile

DNA構(gòu)建模塊需要有一定的剛性才能組裝成更大的結(jié)構(gòu)，但DNA分支結(jié)構(gòu)顯然不能滿足這一要求.Seeman等人通過引入兩個DNA雙螺旋之間的交叉構(gòu)筑了“DNA double-crossover molecule”(DX tile)，主要包括5種DX-tile，3種平行取向的DPE、DPOW、DPON結(jié)構(gòu)和2種反平行的DAE和DAO[44](如圖6所示).其中DPE、DPOW、DPON結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，而DAE和DAO能以穩(wěn)定的雙交叉結(jié)構(gòu)存在[53].DX tile因有兩個穩(wěn)定的crossover連接，因此結(jié)構(gòu)剛性比線性的DNA雙鏈更優(yōu)[54]，能夠進(jìn)一步通過設(shè)計黏性末端，就可以將不同類型的DX tile進(jìn)行特異性結(jié)合，進(jìn)而組裝成周期性的結(jié)構(gòu)[55].

圖6 5種不同排列的雙交叉結(jié)構(gòu)示意圖 [44]

2.1.3 星狀結(jié)構(gòu)模塊(n-point star)

為了合成復(fù)雜的DNA多面體，需要設(shè)計更加穩(wěn)定的DNA結(jié)構(gòu)模塊，“n-point star”即“星狀結(jié)構(gòu)法”是科學(xué)家們在分支結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過超分子自組裝策略實(shí)現(xiàn)的[56].根據(jù)目標(biāo)多面體的頂點(diǎn)度數(shù)不同，設(shè)計不同的星狀結(jié)構(gòu)，如四面體的頂點(diǎn)度數(shù)是三度的，就必須設(shè)計3-point star.2008年毛承德等人設(shè)計了3-星狀結(jié)構(gòu)模塊[56].該模塊由7條DNA相互纏繞并從中心延伸出三個分支，每個分支由兩條通過Holliday交叉連接的DNA雙螺旋，剩余的1條DNA鏈在中心連接三個分支，通過調(diào)節(jié)中心連接的柔性，可再將設(shè)計好的星狀結(jié)構(gòu)組裝成二聚物.這些二聚物會進(jìn)一步組裝成多面體結(jié)構(gòu)，整個組裝過程可以一步且高效完成.如圖7所示，給出了利用“3-星狀結(jié)構(gòu)”合成DNA立方體的示意圖[57].此外，還利用“3-星狀結(jié)構(gòu)”自組裝得到了DNA四面體[56]，十二面體和三十二面體[28]，“4-星狀結(jié)構(gòu)”被用于合成DNA八面體[13]，而“5-星狀結(jié)構(gòu)”被用于合成二十面體[58].

圖7 “3-星狀結(jié)構(gòu)”及合成立方體示意圖 [57]

2.2 DNA折紙術(shù)(DNA Origami)

DNA“折紙術(shù)”的合成策略是加州理工大學(xué)的P.W.K.Rothemund于2006年提出的[10].該方法構(gòu)建了尺寸有限的二維和三維納米結(jié)構(gòu),被視為一個里程碑.迄今為止，科學(xué)家們運(yùn)用DNA折紙技術(shù)先后設(shè)計并合成了數(shù)量眾多的大小可控、幾何和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)各異、功能豐富的納米結(jié)構(gòu).其設(shè)計原理(圖8所示)：設(shè)計一系列的合成寡核苷酸作為短的“訂書釘鏈”，一條長的環(huán)狀DNA單鏈作為“骨架鏈”混合，在特定位置通過堿基互補(bǔ)與雜交，讓“訂書釘鏈”與“腳手架鏈”結(jié)合，固定形狀折疊出預(yù)先設(shè)計的具有固定邊界和尺度的二維或三維納米結(jié)構(gòu).通過折紙術(shù)方法可以擴(kuò)展得到超大結(jié)構(gòu)，能構(gòu)建具有10 nm左右的微米尺寸器件.Rothemund利用M13mp18噬菌體的單鏈DNA(含有7 249個堿基，為目前產(chǎn)品化最高的DNA長單鏈)作為骨架鏈，含8個堿基的訂書針鏈，自下而上組裝得到了DNA Sierpinski三角結(jié)構(gòu)[9].此外，還成功合成了方形、矩形、五角星、笑臉(圖9)等對稱圖形[10].上海交通大學(xué)與中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所合作用DNA折紙術(shù)構(gòu)造了非對稱的中國地圖[59].

圖8 DNA折紙術(shù)原理示意圖 [10]

圖9 DNA折紙術(shù)合成的納米結(jié)構(gòu) [10]

DNA折紙目前有兩個重要類別：一個是多層DNA折紙結(jié)構(gòu)，另一個是線框DNA折紙結(jié)構(gòu).其中Rothemund提出的最原始的DNA折紙方法就屬于多層折紙技術(shù).尺寸較小的納米結(jié)構(gòu)可以將骨架鏈和訂書針鏈通過一鍋反應(yīng)組裝[60].然而，尺寸大且復(fù)雜的結(jié)構(gòu)往往是由幾個不同的支架鏈組裝起來的，每個部分都必須單獨(dú)組裝并純化后才能進(jìn)行超級組裝，實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜且需要高濃度的Mg2+才能保證結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[61].而線框DNA折紙結(jié)構(gòu)允許構(gòu)筑任意的2D和3D幾何形狀[62-63].線框DNA折紙是基于DNA tile的DNA結(jié)構(gòu)的一種變形，其優(yōu)勢在于只需要填充抽象幾何物體邊緣周圍的區(qū)域，路徑計算更簡單且結(jié)構(gòu)的最大尺寸可顯著提高[64].與多層DNA折紙不同的是，線框DNA折紙結(jié)構(gòu)在低濃度Mg2+和生理離子條件下也很穩(wěn)定[65].

2.3 DNA磚塊

DNA磚塊法是一種模塊化的多功能DNA納米結(jié)構(gòu)組裝方式.每個DNA磚塊類似于一塊樂高積木，通過不同方式連接就可以構(gòu)建任意形狀的納米結(jié)構(gòu)，可組裝高達(dá)1 GDa大小的結(jié)構(gòu)[66]，它們由成千上萬個獨(dú)特的部件組成，因此該策略特別適用于構(gòu)建復(fù)雜的三維周期性納米結(jié)構(gòu).

2012年，哈佛大學(xué)的尹鵬提出了DNA磚塊法，這種方法依賴于數(shù)千個短寡核苷酸的組裝[45].每個DNA磚塊包含四個8 nt長的結(jié)構(gòu)域，每塊DNA磚長度是32 bp或者52 bp，能夠結(jié)合其他四個DNA磚塊(圖10).納米結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和總尺寸依賴于單個磚結(jié)合域的長度[67].與DNA折紙術(shù)相比，DNA磚組裝的結(jié)構(gòu)具有更大的靈活性，設(shè)計策略不受骨架鏈長度的限制，而且模塊化的方案也使該方法能通過簡單增加或去除某些特定的鏈就可以構(gòu)建出復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)[68].

圖10 DNA磚塊法原理示意圖 [45]

3 DNA納米結(jié)構(gòu)應(yīng)用研究

DNA納米技術(shù)使制造越來越復(fù)雜的納米結(jié)構(gòu)成為可能.這種制造方法是完全可編程和可復(fù)制的，因?yàn)樗蕾囉贒NA堿基對相互作用的精確特異性.因此，DNA序列可以被合理地設(shè)計成具有明確尺寸、定制形狀和多功能的結(jié)構(gòu).由于這種獨(dú)特的設(shè)計適應(yīng)性，DNA納米技術(shù)已成為多種用途定制納米材料的豐富來源.基于DNA tile或折紙術(shù)的DNA納米結(jié)構(gòu)已被用于細(xì)胞中進(jìn)行藥物傳遞[69]、生物成像[70]和病毒的檢測、治療[71]等.

4 總結(jié)與展望

隨著DNA納米技術(shù)的發(fā)展及功能強(qiáng)大的設(shè)計工具的研發(fā)，最終能實(shí)現(xiàn)無差錯的DNA自組裝.科學(xué)家們將進(jìn)一步開發(fā)設(shè)計軟件，改進(jìn)合成技術(shù)實(shí)現(xiàn)對原子的精確操縱，從而制備納米尺度的納米構(gòu)件和納米器件的通用元件.DNA納米技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為很熱門的研究領(lǐng)域.在納米器件、基因診療、DNA計算機(jī)等領(lǐng)域?qū)缪菰絹碓街匾慕巧?未來DNA納米技術(shù)的推廣和應(yīng)用將帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益,同時會推動相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)飛躍.當(dāng)然，要實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)還需要克服許多難題，還要經(jīng)過漫長的產(chǎn)業(yè)化過程.