不同批次新生牛血清對CHO細胞培養效果的研究

馬春英，王美皓，馬 花，佛生福，喬自林，馬忠仁，王家敏

(1.西北民族大學 生物醫學研究中心甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；4.蘭州百靈生物技術有限公司，甘肅 蘭州 730010)

CHO細胞(Chinese hamster ovary cell)由Puck TT于1957年從成年中國倉鼠卵巢組織分離、培養、建立的，呈上皮樣貼壁生長.該細胞被廣泛應用于各種診斷性、治療性蛋白質的表達，包括重組抗體、重組單體蛋白及重組融合蛋白等，CHO細胞已經成為了生物制品領域最主要的生產細胞[1-5].貼壁型的傳代細胞可用細胞工廠和微載體技術規模化培養，生產中可將細胞生長和蛋白表達控制在最適條件范圍內，提高細胞密度和蛋白表達量，實現大批次量、小批間差，產品更具有穩定性和安全性，節省大量的勞動力、生產場地和能源消耗，降低生產成本[6-7].血清具有終止胰蛋白酶消化，提供細胞生長所需的貼壁因子、免疫球蛋白、胰島素等其他營養物質.在動物血清中牛血清又是最常用、最合適、最有效的培養基成分.在培養基中加入適量的牛血清，不僅可以有效促進細胞的生長繁殖，還能夠縮短細胞的生長周期，從而加快生物制品的生產，提高生物制品的產量，為生物制品生產企業帶來更多的利潤[8].目前市場上血清種類繁多，質量參差不齊，因此研究不同種類血清對細胞培養的影響，建立快速有效的血清篩選方法具有重要的現實意義[9].本文通過蘭州民海生物工程有限公司生產的不同批號國產優級新生牛血清對CHO細胞復蘇和傳代培養的對比試驗研究，尋找對CHO細胞培養效果最佳的國產新生牛血清，從而為生物制品的研發節約成本、節省時間.

1 材料與方法

1.1 材料

細胞：貼壁培養型CHO細胞從ATCC引進，引進后由甘肅省動物細胞技術創新中心凍存.

培養基：F12購自蘭州百靈生物技術有限公司，批號20170115.

血清：6個批號的新生牛血清，購自蘭州民海生物工程有限公司，使用時按10%(V/V)添加到培養基中，編號及批號信息見表1.

表1 新生牛血清編號及批號信息表

微載體：Cytodex1，GE Healthcare Cytodex-1；貨號：17-0488-03；批號：10225274；產地：瑞典；包裝：5kg；有效期：2022.04.

微載體處理方法：稱取10 g微載體至2 L微載體處理瓶中，加入1.0 L(10 g)新鮮配制的PBS(無Ca2+、Mg2+，pH7.2)溶脹3h，再用PBS(無Ca2+、Mg2+，pH7.2)清洗3遍，定容至1.0 L(10 g)，121 ℃、60 min高壓滅菌，滅菌結束后，待載體放置室溫用F12清洗3遍后定容至475 mL，最后補加25 mL新生牛血清(10% NBS)，配制成20 g/L濃度的微載體懸液，取樣菌檢.

主要試劑及儀器：0.25%胰蛋白酶、0.2%臺盼藍、結晶紫染液、T75細胞培養瓶、60 mm細胞培養皿、250 mL雙側臂懸浮培養瓶、磁力攪拌器、生物微倒置顯微鏡、CO2培養箱、細胞計數儀等.

1.2 方法

1.2.1 靜置培養CHO細胞傳代穩定性觀察

用含有10% 新生牛血清的F12完全培養基復蘇CHO細胞，待細胞生長至致密單層時，分別用含有6個批號新生牛血清的F12培養基培養并連續傳代5代，傳代時細胞均按照1∶4比例，置于5%CO2、37 ℃培養箱中培養.每代細胞在24 h、48 h拍照觀察細胞形態、長勢、致密程度.

1.2.2 靜置培養CHO細胞克隆形成率分析

克隆形成率是指貼壁細胞在低細胞密度下的集落形成，也就是克隆效率，是判斷細胞增殖能力的重要指標之一.取第3代、第4代、第5代的6個批號新生牛血清培養生長狀態良好且鋪滿單層的CHO細胞，消化，制成細胞懸液，按照100個細胞/皿的細胞量接種細胞培養皿，并做平行3皿.將細胞培養皿放置5%CO2、37 ℃培養箱中進行培養8天，出現集落后，用吸管吸去培養液，用PBS清洗，無水甲醇固定，結晶紫染色.觀察并對細胞集落計數，計算平均值.

克隆形成率(%)=(所形成集落數/接種細胞數)×100%

1.2.3 微載體懸浮培養CHO細胞生長狀態、生長曲線及生長動力學分析

取第5代6個批號新生牛血清培養生長狀態良好且鋪滿單層的CHO細胞，分別用0.25%的胰蛋白酶消化，用0.2%臺盼藍染色計數，在250 mL雙側臂懸浮培養瓶中，按細胞15個/球，接種至200 mL 2 g/L Cytodex1微載體懸液內，50 rpm、5%CO2、37 ℃培養，每24 h取樣觀察細胞生長狀態，結晶紫計數.按照此方法，對培養至第6代、第9代的CHO細胞重復上述試驗，計算三次平均值，繪制細胞生長曲線.并比較6個批號新生牛血清培養CHO細胞的平均最大増殖密度、平均倍增時間[10]、平均比生長速率[11].

倍增時間=T/A，A=log2(Y/X)

X為初始接種細胞數，Y為細胞最大増殖密度前一天的細胞數，T為培養時間.

比生長速率=(lnXn/Xn-1)/(tn-tn-1)

X為活細胞密度，t為培養時間，n和n-1為2個取樣計數時間點.

1.2.4 使用Graphpad prism 8軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 靜置培養CHO細胞傳代穩定性觀察

分別用含有10%血清復蘇CHO工作庫細胞，細胞生長良好(圖1)，傳代2代后轉為分別含有6個批號新生牛血清培養，連續傳代培養5代，均能較好促進細胞的生長增殖，細胞形態呈扁平狀，形態較為規則，細胞貼壁后呈三角形及不規則扁平的多角形，中央有扁圓形核，細胞之間相互銜接或呈鑲嵌狀緊密排列.6個批號新生牛血清分別培養CHO細胞至第5代效果(見圖2)，結果發現6個批號新生牛血清培養CHO細胞長勢和形態無明顯差異.

圖1 CHO細胞復蘇靜置培養狀態(A:24h,40×；B:48h,40×)

圖2 6個批號新生牛血清靜置培養CHO細胞(第5代)效果比較(40×)

2.2 靜置培養CHO細胞克隆率分析

6個批號新生牛血清培養CHO細胞均形成了有效的集落數，平均集落形成率從高到低依次為D、F、B、E、C、A血清組，分別為103.67±2.33%，93.67±2.33%，84.00±2.00%，57.00±6.00%，51.33±3.33%，37.67±1.67%，且D、F、B組顯著高于E組，A組顯著低于E組(P<0.05).集落形成效果見圖3，克隆形成率分析結果見圖4.

圖3 6個批號新生牛血清靜置培養CHO細胞形成集落

圖4 6個批號新生牛血清靜置培養CHO細胞克隆率比較

2.3 微載體懸浮培養CHO細胞生長狀態、生長曲線及生長動力學分析

6個批號新生牛血清微載體懸浮培養CHO細胞效果比較見圖5，生長曲線分析見圖6，平均比生長速率分析見圖7，平均最大增殖密度和平均倍增時間比較分析見圖8、圖9和表2.6個批號新生牛血清均能實現CHO細胞的微載體懸浮培養，對比發現B、D、F優于A、C，E最差；細胞生長曲線均呈“S”型，但D、F、B試驗組能較好促進CHO細胞的生長增殖，生長動力學分析發現平均比生長速率、平均倍增時間和最大增殖濃度從高到低依次為D、F、B、E、A、C血清組，且D、F組顯著高于E組(P<0.05).

圖5 6個批號新生牛血清分別微載體懸浮培養CHO細胞效果比較(100×)

圖6 6個批號新生牛血清微載體懸浮培養CHO細胞生長曲線

圖7 6個批號新生牛血清微載體懸浮培養CHO細胞平均比生長速率(*P<0.05)

圖8 6個批號新生牛血清培養CHO細胞微載體懸浮平均倍增時間

圖9 6個批號新生牛血清培養CHO細胞微載體懸浮平均最大增殖密度

表2 6個批號新生牛血清CHO細胞微載體懸浮培養平均倍增時間和平均最大增殖密度

3 討論與結論

CHO 細胞系在生物制藥領域備受矚目，主要原因：首先，CHO 細胞系具有很高的安全性(CHO基因組內不攜帶任何人源性病毒)；其次，CHO細胞系表達的重組蛋白能夠獲得類似于人源蛋白的翻譯后修飾，表達的重組蛋白更具生物活性[12].

在培養貼壁型CHO細胞時，血清是最常用、最合適、最有效的培養基成分.血清選擇不當，不僅會導致細胞生長緩慢、連續傳代培養過程中細胞生長不穩定，而且由于血清價格昂貴，大規模生產時成本高.血清的選擇直接關系到研發進度和生物制品生產企業的經濟效益[13].本研究針對以上問題，分別用靜置培養傳代穩定性觀察、克隆形成率和微載體懸浮培養生長曲線、生長動力學分析評價了國產新生牛血清對CHO貼壁細胞的促生長效果的影響.結果顯示，6個批次血清中，CHO細胞在3組新生牛血清中能連續傳代和擴大培養，細胞生長動力學較穩定.

本試驗通過研究不同批次的新生牛血清對CHO細胞培養效果的影響，不僅在短時間內成功篩選出了培養CHO細胞的最佳血清，而且也為生物制品生產中CHO細胞擴大培養提供試驗依據.這種快速有效的血清篩選方法縮短了疫苗研發、生產的時間，節省了疫苗企業的生產成本.

本研究中6個批號的國產新生牛血清培養CHO細胞均形成了有效的集落數，平均集落形成率從高到低依次為D、F、B、E、C、A血清組，分別為103.67±2.33%，93.67±2.33%，84.00±2.00%，57.00±6.00%，51.33±3.33%，37.67±1.67%.6個批號新生牛血清均能實現CHO細胞的微載體懸浮培養，對比發現B、D、F優于A、C，E最差，且D、F、B組顯著高于E組，A組顯著低于E組(P<0.05)；生長動力學分析發現平均比生長速率、平均倍增時間和最大增殖濃度從高到低依次為D、F、B、E、C、A血清組，且D、F組顯著高于E組(P<0.05).這可能與不同批次新生牛血清中所含的激素及其他活性物質等組份與比例不同有關[14-15].如纖維粘連素、胰島素、α2巨球蛋白、胎球蛋白、轉鐵蛋白、血小板促生長因子、表皮細胞生長因子、神經細胞生長因子等在細胞培養中各自發揮的生理功能，還有待進一步研究.另外，胎牛血清的免疫球蛋白含量要遠遠低于新生牛血清，胎牛的血清相對來說比較純，所以培養細胞的效果會更佳[16].除此之外還可能是由于牛血清中存在大量的脂蛋白，貯存不當會造成血清營養流失，導致給細胞供應營養的能力減弱，造成了細胞的生長緩慢[17-18].