DJ-1抗氧化應激作用及機制的研究進展

顏楊林，彭吾訓，張飛

(1.貴州醫科大學，貴陽550004;2.貴州醫科大學附屬醫院創傷骨科，貴陽550004)

機體生理條件下有一套完整且全面的代謝循環系統，細胞內的氧化反應與抗氧化反應處于動態平衡狀態［1］。氧化應激是指機體遭受外界因素刺激后，體內氧化與抗氧化作用失衡，大量的氧自由基對組織細胞造成損傷的過程［2］。氧化應激是導致許多疾病發生的一個早期重要因素。機體受到外界因素刺激產生氧化應激可導致全身或局部組織器官損傷，常見的疾病包括腦缺血性相關性疾病、心肌缺血性疾病、股骨頭缺血壞死等，這些疾病的主要致病因素是組織急慢性缺血缺氧，導致細胞的氧化與抗氧化防御系統失衡，細胞內活性氧類(reactive oxygen species，ROS)蓄積，而大量的ROS可損傷DNA、蛋白質、脂質等生物大分子，改變完整的細胞結構和功能［3］。ROS還可導致線粒體電子傳遞鏈功能障礙、ATP合成受阻、跨膜電位下降、膜通透性改變、細胞色素C和凋亡誘導因子釋放，誘導細胞凋亡，最終損傷組織器官至不可逆的程度［4］。若能在疾病早期進行抗氧化應激治療，可修復受損的組織及細胞，從而減少組織器官損傷。DJ－1蛋白存在于人及動物的不同細胞中，對各組織器官均有抗氧化應激保護作用［5－6］。有研究使用骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)進行氧化應激預處理，使BMSC發生抗氧化應激，通過基因測序發現BMSC中DJ－1基因表達明顯升高，且通過慢病毒轉染DJ－1基因后DJ－1高表達可降低BMSC在氧化應激條件下的凋亡率，增強股骨頭壞死區BMSC的存活、增殖、分化能力，并提高移植區BMSC對股骨頭壞死的修復效果［7－8］。現就DJ－1抗氧化應激的作用及機制進行綜述。

1 DJ-1的概述

DJ－1是目前公認的一種多功能蛋白質，對介導細胞生命活動有重要作用。DJ－1基因又稱為帕金森病蛋白7基因家族，最初發現于家族性帕金森病相關的第3個基因，認為該基因與增強RAS/促分裂原活化的蛋白激酶通路相關，隨著研究的深入發現DJ－1與常染色體隱性遺傳性青少年帕金森病中神經細胞氧化應激引起的多巴胺能神經元變性密不可分［9－10］。DJ－1基因位于人類染色體1p36.2～p36.3，全長大約24 kb，分子量為20 000，包含8個外顯子，其中第1、2外顯子1A、1B的信使RNA可以被選擇性剪切，為不參與編碼的外顯子;外顯子2～7為編碼序列，包含1個約570 bp的開放閱讀框，可編碼189個氨基酸殘基的DJ－1蛋白［11］。DJ－1蛋白屬于DJ－1蛋白/ThiJ/PfpI超蛋白家族，全長編碼序列為567 bp，有8個螺旋和11個折疊組成，中間為β片層結構，外周為α螺旋結構，其中β3和β4折疊成一個β發夾結構，并以同源二聚體的形式存在，該結構參與DJ－1蛋白的二聚化;β8、β9和αF構成一個β－α－β類似“三明治”結構的基序，此基序與DJ－1活性點His126殘基活性的保持相關。其亞型共有17種，所含DJ－1亞型的含量不同，也決定了DJ－1蛋白應對各種刺激時的反應，同時詮釋了DJ－1蛋白功能的多樣性［10］。

2 DJ-1抗氧化應激作用

氧化應激可加速機體的衰老，累及神經、循環、內分泌等系統，常見的疾病包括阿爾茨海默病、冠狀動脈粥樣硬化、糖尿病、骨性關節炎等。目前對于抗氧化應激的治療方法主要包括補充抗氧化劑和其他藥物治療，對于機體局部組織器官急慢性缺血缺氧所致的氧化應激反應，使用補充抗氧化劑和藥物治療效果并不確定;目前使用基因修飾調控細胞自身抗氧化應激能力是治療氧化應激所致相關疾病的研究熱點［12］。Zhang等［7］在早期股骨頭缺血性壞死的實驗研究中，通過對BMSC氧化應激預實驗發現DJ－1具有強大的抗氧化應激作用。有實驗發現，小鼠BMSC中DJ－1基因與人DJ－1基因的同源性高達90%［13］。利用小鼠體外實驗，提取小鼠BMSC進行體外培養，通過慢病毒轉染DJ－1基因使DJ－1在BMSC中高表達。DJ－1高表達的BMSC細胞系具有抗氧化應激作用，通過體外實驗使用高濃度H2O2模擬氧化應激微環境，分別對各實驗組細胞凋亡率、線粒體膜電位、細胞內ROS的含量等氧化應激相關指標進行檢測發現，DJ－1過表達組凋亡率顯著低于對照組，線粒體膜電位基本正常，細胞內ROS含量較少［7－8］。DJ－1增強細胞抗氧化應激的作用可能是通過增加細胞內抗氧化酶蛋白含量實現的。當細胞受到氧化應激刺激時，細胞內線粒體膜電位下降，大量的ROS堆積，而DJ－1可能通過調控細胞內多種抗氧化應激分子信號通路，增加細胞內抗氧化酶含量，增強細胞對ROS的清除能力，減少細胞內ROS的堆積，使細胞恢復氧化還原平衡狀態，從而減少ROS對細胞的損傷，提高細胞存活率［14－15］。

DJ－1可用于治療心肌缺血性相關疾病，如急性心肌梗死、變異型心絞痛等。在心肌缺血再灌注損傷過程中心肌細胞發生氧化應激產生大量的ROS，抑制心肌細胞中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶的表達，進一步降低心肌細胞的抗氧化應激能力。有研究對H9c2心肌樣細胞進行DJ－1基因轉染，對H9c2心肌樣細胞進行缺氧和復氧實驗發現DJ－1高表達組的H9c2心肌樣細胞凋亡率低于未處理組，且DJ－1高表達的H9c2心肌樣細胞內抗氧化酶蛋白含量高于未處理組［16］。有文獻報道，核因子紅系2相關因子2(nuclear factor－erythroid 2－related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)內源性抗氧化應激信號通路是DJ－1蛋白增強細胞抗氧化酶表達的下游通路，Nrf2－ARE信號通路的激活可增加細胞內抗氧化酶(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶)的水平，通過酶促反應增強細胞內ROS的清除速率，減少ROS對細胞的損害［17］。

帕金森病中神經細胞發生氧化應激與多巴胺能神經元變性關系密切。目前認為DJ－1可通過序列46、53和106處的半胱氨酸殘基自氧化來清除ROS，減少神經細胞損傷，抑制帕金森病的發生發展［13，18］。在氧化應激條件下，神經細胞中的DJ－1過表達可減少魚藤酮和1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶對細胞的損傷，同時上調酪氨酸羥化酶的轉錄，DJ－1通過自身氧化作用與多巴胺合成酶結合，并激活多巴胺的合成，最終發揮調節多巴胺新陳代謝和內穩態的作用［13］。帕金森病與線粒體功能障礙密切相關，線粒體功能障礙導致細胞內ROS大量蓄積，最終導致細胞啟動凋亡程序，促使細胞凋亡。DJ－1具有調節線粒體功能的作用，主要體現在DJ－1可控制線粒體復合體Ⅰ(ComplexⅠ)的活性，當DJ－1的突變體(L166P和M261)以單體在線粒體內聚集時，DJ－1在氧化應激情況下轉移至線粒體內膜，這些DJ－1能夠維持ComplexⅠ活性并提高線粒體和胞質中ATP的水平［19－21］;DJ－1也參與調控線粒體穩態、形態、自噬等，進一步改善線粒體功能［22－23］。由此可見，在帕金森病中DJ－1通過調控線粒體功能增強神經細胞的抗氧化應激能力。此外，DJ－1廣泛存在于多種細胞，DJ－1可促進肝損傷再修復，維持生殖細胞中線粒體功能，腸道上皮細胞中DJ－1缺乏可加重潰瘍性結腸炎癥狀［24－26］。

3 DJ-1抗氧化應激損傷的機制

3.1 DJ－1調控Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch－like ECH－associated protein 1，Keap1)－Nrf2－ARE信號通路抗氧化應激機制 DJ－1蛋白具有強大的抗氧化應激作用，了解DJ－1抗氧化應激的分子機制對臨床治療相關疾病及實驗研究尤為重要。DJ－1蛋白廣泛分于人體內皮細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、間充質干細胞、神經元細胞及各類腫瘤細胞［10，27－29］;在細胞中，DJ－1蛋白主要分布于細胞質，線粒體及細胞核內有少量分布。當細胞受到ROS、活性氮及親核劑的刺激誘導，位于細胞質中的DJ－1蛋白可作用于Keap1/Nrf2復合體的BTB(bric－α－brac/tramtrack/broad complex)結構域，促使其解離;解離活化的Nrf2具有極強的轉錄激活作用;當活化的Nrf2入核后，可通過自身的環氧丙氯烷相關蛋白同源結構域中的亮氨酸拉鏈結構與小Maf蛋白結合形成二聚體，從而識別抗氧化酶基因上ARE序列(CTCACTCAGCA)，啟動抗氧化酶基因的轉錄;最終調控抗氧化相關蛋白表達，如過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、硫氧還蛋白1、醌氧化還原酶1等發揮抗氧化應激損傷的功能［30－31］，見圖1。在DJ－1－Keap1－Nrf2－ARE信號通路的研究中，DJ－1的主要作用是與細胞質中的Keap1－Nrf2復合體結合，其結合區域是BTB結構域，使Keap1－Nrf2復合體形成Keap1、Nrf2單體，解離活化的Nrf2單體入核，再促使下游基因的表達［32］。

External harmful stimulation:外部有害刺激;cytoplasm:細胞質;Cell membrane:細胞膜;Nucleus:細胞核;ROS:活性氧類;DJ－1:帕金森蛋白7;Nrf2:核因子紅系2相關因子2;Keap1:Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1;ARE:抗氧化反應元件;MOD:超氧化物歧化酶;CAT:過氧化氫酶;GPx:過氧化物酶

3.2 DJ－1調控磷脂酰肌醇－3－激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol－3－kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路抗氧化應激機制 DJ－1可激活PI3K/Akt信號通路進而發揮神經保護作用。PI3K/Akt信號通路的激活需PI3K與含有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體反應，使PI3K構象發生改變，或通過Ras蛋白與PI3K亞基p110結合，使PI3K活化。活化的PI3K將磷脂酰肌醇－4，5－三磷酸轉化為磷脂酰肌醇－3，4，5－三磷酸。磷脂酰肌醇－3，4，5－三磷酸與Akt蛋白的PH結構域結合，使Akt蛋白由細胞質轉移至細胞膜，在細胞膜上的Akt蛋白Thr308位點、Ser473位點分別與磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1、磷酸肌醇依賴性蛋白激酶2結合，進而活化Akt;激活的Akt又從細胞膜轉移至細胞核，促進下游靶蛋白［如B細胞淋巴瘤(B cell lymphoma，Bcl)－xl/Bcl－2死亡相關因子、胱天蛋白酶9］磷酸化，從而抑制細胞凋亡;Akt磷酸化核因子κB后，激活核因子κB轉錄功能，促進Bcl－2基因的表達，從而提高細胞存活率［33］，見圖2。有研究報道，DJ－1過表達可顯著上調PI3K/Akt信號通路中Akt磷酸化Thr308位點，從而促進Akt磷酸化，起到保護神經細胞的作用，而對于另一個Ser473蛋白位點的磷酸化水平無明顯改變［34］。明確DJ－1在神經細胞抗氧化應激的機制可為早期神經細胞受損的治療提供實驗依據。

圖2 DJ-1調控PI3K/Akt信號通路抗氧化應激機制

3.3 DJ－1調節胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal－regulated kinase 1/2，ERK1/2)信號通路抗氧化應激機制 在神經細胞中，目前對DJ－1較為認可的抗氧化應激機制是ERK1/2通路，這是經典的促分裂原活化的蛋白激酶信號轉導級聯，可調節細胞增殖、生長、自噬和分化。生長因子、多肽激素、神經遞質、趨化因子等可激活各種受體和蛋白質，如受體酪氨酸激酶、G蛋白偶聯受體和蛋白激酶C可激活ERK1/2通路;ERK1/2是由促分裂原活化的蛋白激酶激酶1/2(mitogen－activated protein kinase kinase 1/2，MEK1/2)介導的磷酸化正向調控的絲氨酸－蘇氨酸激酶，MEK1/2是以ERK1/2為底物的促分裂原活化的蛋白激酶［14］。DJ－1可激活ERK1/2通路，介導細胞存活和增殖，當DJ－1直接與c－Raf基因結合時可增強Ser－338處的c－Raf磷酸化，然后激活MEK和ERK1/2分子信號通路。DJ－1也可直接與ERK1/2相互作用并增強ERK1/2的核易位，ERK1/2通過激活ETS癌基因轉錄因子增強錳超氧化物歧化酶的轉錄。激活ERK1/2通路可活化轉錄因子核受體相關1蛋白，從而調節酶酪氨酸羥化酶、L－多巴脫羧酶、水泡單胺轉運蛋白2的表達，以及酪氨酸羥化酶的轉錄，發揮調節多巴胺穩態的作用。在氧化應激條件下DJ－1與p53的DNA結合域結合，并干擾p53的轉錄活性，使p53轉錄活性被抑制，減少p53對細胞核中ERK1/2活性的抑制，從而起到增強抗氧化應激的作用［14，35］。DJ－1通過直接或間接與ERK1/2結合，促進下游靶點的表達，增加細胞內抗氧化酶的含量，見圖3。

圖3 DJ-1調節ERK1/2信號通路抗氧化應激機制

3.4 DJ－1調節線粒體抗氧化應激的機制 線粒體是利用細胞內氧化磷酸的形式生成大量ATP，但線粒體也是產生ROS的重要細胞器。線粒體呼吸鏈復合體位于線粒體內膜，包括ComplexⅠ～Ⅳ和ATP合成酶，是ATP合成的核心部位;ComplexⅠ功能障礙是產生ROS的重要原因，而DJ－1在維持ComplexⅠ活性、抑制ROS的釋放中起重要作用［19－20］。DJ－1可改善線粒體功能，減少線粒體中ROS的產生。當細胞受外界刺激時，DJ－1易位進入線粒體定位于內膜，此時DJ－1與線粒體熱激蛋白70/葡萄糖調節蛋白75共同作用，發揮后續的保護作用［36－37］。有文獻報道，DJ－1由細胞質轉移至線粒體內膜，與線粒體ComplexⅠ的亞基結合，參與ComplexⅠ的活性調節;DJ－1可能通過對ComplexⅠ的保護及活性調節改善線粒體功能［38］，見圖4。有研究推測，在氧化應激刺激下，細胞的線粒體膜電位降低，線粒體膜通透性發生改變，從而促使DJ－1進入線粒體內膜［39］。

圖4 DJ-1調節線粒體抗氧化應激的機制

DJ－1可參與線粒體形態的調節，對維持線粒體正常形態有重要作用。在細胞炎癥反應中，細胞受到外界刺激后發生氧化應激，ROS累積可使線粒體形態發生改變。ROS的累積使細胞內線粒體出現片段化和自噬體，進而分解線粒體的網狀系統［23］。DJ－1基因過表達時，DJ－1蛋白使線粒體的動力蛋白相關蛋白1磷酸化，在體內和體外均出現伸長的現象，線粒體的伸長可避免被自噬降解，維持自身形態。DJ－1表達下調后，調控線粒體的動力蛋白相關蛋白1磷酸化明顯降低，線粒體片段化程度明顯增加［23，28］。線粒體的形態受到融合和分裂相關因子比例的調節，當DJ－1異常表達時，融合和分裂相關因子比例發生改變，從而導致線粒體形體發生改變［40］。

4 小 結

細胞氧化應激損傷是多種疾病發病早期的關鍵因素，目前抗氧化應激的治療方式較多。調控細胞內抗氧化相關基因的表達可增強細胞抗氧化應激能力，提高細胞存活率。細胞中DJ－1參與調節Keap1－Nrf2－ARE、PI3K/Akt、ERK1/2、p53分子信號通路，增強細胞抗氧化酶蛋白表達，促進細胞內ROS的清除率，恢復其氧化還原平衡，進而增強細胞抗氧化應激能力;同時，DJ－1通過與線粒體內膜結合，參與線粒體ComplexⅠ的活性調節，從而減少ROS的產生并促進線粒體內膜ATP生成，進而調節線粒體功能;DJ－1還可維持線粒體形態，避免被其裂解。DJ－1通過多種抗氧化應激途徑，增強細胞抗氧化應激能力。DJ－1過表達除有效增強細胞抗氧化應激外，還對細胞的生長、增殖、分化具有重要影響。DJ－1轉染BMSC移植治療局部氧化應激損傷相關疾病仍是目前研究的熱點。