蛋白質組學在唐氏綜合征產前篩查中的應用

趙晟隆，張為遠

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院圍產醫學部，北京100026)

唐氏綜合征是活產兒中最常見的非整倍體常染色體疾病，由第21號染色體的三倍體引起，表型累及身體多個系統，尤其是骨骼、肌肉和心血管系統，患者通常有身材矮小、肌張力低下、寰樞椎不穩定、神經元密度降低、腦發育不全、智力障礙和先天性心臟病(尤其是房室間隔缺損)等。唐氏綜合征患者還易并發甲狀腺功能減退、自身免疫性疾病、阻塞性睡眠呼吸暫停、癲癇、聽力和視力障礙、血液系統疾病(包括白血病)、復發感染、焦慮癥和早發性阿爾茨海默病等疾?。?－2］。全球唐氏綜合征患病率為7∶5 000;新生兒唐氏綜合征發病率為1∶1 000［3］;中國新生兒唐氏綜合征發病率為1∶800［4］。目前，唐氏綜合征的表型癥狀難以治愈，導致患病個體及其家庭的生活質量受到嚴重影響。因此，明確的產前篩查結果是診斷胎兒唐氏綜合征的重要線索?，F對母血、羊水、胎盤和臍血中的蛋白質組學研究及其在唐氏綜合征產前篩查中的應用予以綜述。

1 蛋白質組學簡介

染色體異常導致基因表達量和質的差異，基因通過其所表達的蛋白質發揮對生命體的調控功能，蛋白質變化是生命功能失常的直接因素，隨著研究的不斷深入，蛋白質組學應運而生［5］。蛋白質組學為“一種細胞、組織或有機體所表達的全部蛋白質”，已被作為研究胎兒狀況和妊娠相關疾病的平臺，如胎兒非整倍體、早產、子癇前期、宮內感染和胎兒窘迫［6］。目前，需要通過一種更安全、更快速的替代有創羊膜腔穿刺術的非侵入性方法，并利用其獲得的生物樣本材料［如母體各種體液樣本(如血漿、血清、尿液、宮頸黏液、陰道分泌物、唾液和羊水)和胎兒樣本(如胎盤滋養細胞、胎膜和臍血)］尋找妊娠相關病理標志物［7］。

2 蛋白質組學的方法和技術

根據標本的性質進行樣品分離、制備和破碎，且肽和蛋白質水平的分離步驟可能有所不同。鑒定蛋白質組學所使用的標記策略和總體方法匯總見表1。

表1 蛋白質組學技術及其功能

2.1 雙向凝膠電泳 雙向凝膠電泳是利用蛋白質的等電點和分子質量兩項獨立的物理化學參數來分離復雜的蛋白質混合物。等電聚焦是通過電流通過時形成電壓梯度的電解質溶液來實現［8］。在電場的作用下，蛋白質根據電荷遷移到pH值與蛋白質等電點相匹配的電解質區域。蛋白質在第一個維度被電荷分離，而在第二個維度則根據它們的質量不同而被分離，分子量分離是基于電場作用下蛋白質遷移速率的差異，通過聚丙烯酰胺凝膠中的電泳來實現的［6］。

2.2 質譜法 質譜是研究蛋白質混合物最有效的方法之一，適用于特定研究任務的高通量色譜－質譜分析策略在蛋白質形式研究方法中占據核心地位。根據研究目的將基于質譜的蛋白質組學方法分為適合篩選研究的鳥槍法以及用于分析特定蛋白質形式的靶向性方法［9］。在典型的蛋白質組學研究中，在質譜前行色譜分離，其允許在一個由兩個接觸的非混合相組成的系統中分離多肽，其中一個相通常相對于另一個相是流動的，即固定相移動［10］。

2.3 酶聯免疫吸附試驗(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA) ELISA是一種基于蛋白質畸變定位的方法，被用來鑒定病理生理條件。通過固定在固體表面的抗原與添加酶偶聯抗體之間的相互作用來測量酶活性的波動，酶活性的波動與樣品中的抗原抗體濃度成正比。ELISA基于固定的蛋白質(抗體)功能活性以及高度特異性的抗體－酶復合物相互作用兩個原則［11］。

3 蛋白質組學技術篩選唐氏綜合征標志物

胎兒發育異常反映在完整細胞、核酸(DNA和信使RNA)、多肽、蛋白質和酶等方面，它們在孕期保持著動態平衡，以維持正常的生理功能;胎兒發育異常會破壞這種固有平衡，引起蛋白質表達水平的改變［12］。既往有學者嘗試利用基因組學探索新的負責表達生理變異的基因，但由于人類蛋白質組研究的復雜性，研究進展并不令人滿意［13］。近年蛋白質組學技術才被用于妊娠研究，如通過識別正常胎兒和異常胎兒蛋白質的差異可能揭示特定疾病的發生途徑，以加深對胎兒發育的認識和了解［14］。

3.1 母血特異性蛋白的篩選 早在2007年，Nagalla等［15］采用多種互補的蛋白質組學方法(包括熒光二維凝膠電泳、二維液相色譜－色譜聚焦、多維蛋白質鑒定技術和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜多肽圖譜)對56例唐氏綜合征篩查陽性孕婦［包括20例妊娠早期(孕11～13周)、36例妊娠中期(孕15～18周)］和56名正常妊娠女性的血清樣本進行分析發現，妊娠早期和中期的母體血清學樣本中分別有28種和26種蛋白的表達水平存在差異，其中孕早期19種、孕中期16種，孕早期和孕中期共有的蛋白10種。

基于質譜計數的多維蛋白質鑒定技術數據定量分析的蛋白有α1－酸性糖蛋白、血清淀粉樣蛋白A、內α－胰蛋白酶抑制劑重鏈H4、血管緊張素原、載脂蛋白C－Ⅰ、纖維蛋白、血小板堿性蛋白、甲狀腺素運載蛋白、載脂蛋白D和妊娠特異性糖蛋白。理論上，蛋白質組學可以識別單一、高度選擇性的疾病生物標志物。然而，經目前反復研究證實，單個分子與特定疾病表型關聯的確定不足以詳細評估病理或有效預測疾病結果。相反，雖然覆蓋疾病復雜性的生物標志物(橫切面或縱切面)組合對個體間的變化不敏感，但更適合描述或代表疾病情況［16］。蔣瀅等［17］對7份確診唐氏綜合征胎兒的孕中期(14～20周)母體血清和同期7份正常胎兒母體血清行二維凝膠電泳顯示，唐氏綜合征組母體血清中表達差異1.5倍以上的蛋白質點29個，其中19個表達上調、10個表達下調;且經質譜分析有12個蛋白質與差異表達2倍以上的8個蛋白質點匹配，該組蛋白可能與載脂肪蛋白類、絲氨酸蛋白酶類、β2糖蛋白類、激肽原類和補體C3類等有關;經蛋白質印跡驗證發現，脫氧鳥苷三磷酸酶和β2糖蛋白1在唐氏綜合征胎兒孕中期母體血清中高表達。

由于雙向凝膠電泳的局限性，現代蛋白質組學研究大多采用電子噴霧質譜進行蛋白質組學分析，并主要依靠同位素標記相對和絕對定量技術進行定量分析，現已證明該系統非常有效［18］。López Uriarte等［3］采用納米升級超高效液相色譜－質譜聯用技術分析不同組別(10例未妊娠、10例正常妊娠、9例唐氏綜合征妊娠)女性血清標本蛋白水平的差異發現，未妊娠女性血清標本中有10種蛋白質，正常妊娠女性血清標本中有8種蛋白質，而唐氏綜合征胎兒孕婦血清標本有42種蛋白質(包括C4b結合蛋白α鏈、間α－解密蛋白抑制劑重鏈H1、血液結合素、載脂蛋白E、激肽原1，亞型CRA－b、β2糖蛋白1、α1－酸性糖蛋白、補體因子H等);妊娠兩組女性血清中均含有大量的蛋白質，其中35種蛋白質一致。

基因調控是了解疾病機制的關鍵，因此利用同位素標記相對和絕對定量技術進行蛋白質定量有助于同時鑒定和定量蛋白質［19］。Zhao等［20］使用同位素標記相對和絕對定量技術對10名未妊娠女性、10名正常妊娠女性和10例唐氏綜合征胎兒妊娠母體血清蛋白水平的變化進行定量分析發現，唐氏綜合征胎兒組和正常胎兒組的11種蛋白質血清水平比較差異有統計學意義，其中6種蛋白質水平上調、5種蛋白質水平下調，4種蛋白質(妊娠特異性β1糖蛋白、組織蛋白酶D、血清淀粉樣蛋白A2和血清淀粉樣蛋白A)可能與唐氏綜合征相關。

3.2 羊水標志物的篩選 自20世紀50年代以來，羊水細胞被廣泛應用于胎兒畸形的產前診斷。妊娠中期的羊水細胞數量為10～1 000個/μL，其通過產生的多種因子(細胞因子、脂質和前列腺素等)應答來自自分泌、旁分泌和內分泌的信號［21］。由于上述內分泌因子均在羊水中產生，羊水中含有大量根據基因型構成和母胎調節而表達的蛋白質，此類蛋白質包括酶、結構蛋白、熱激蛋白和信號轉導蛋白等，其構成的平衡是孕期胎兒健康發育所必需的，而蛋白質構成的不平衡可導致妊娠并發癥的發生，這為疾病研究提供了新的視角［22－23］。

目前唐氏綜合征主要通過測定甲胎蛋白、人絨毛膜促性腺激素和二聚體抑制素A水平進行篩查，通常在妊娠15周左右進行，假陰性率為22%～25%［24］。微陣列可在細胞水平上發現信使RNA表達的變化，但并不能提供關于細胞蛋白質組的全面信息［25］。因此，需要更有效的直接測量蛋白質表達的方法，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術目前仍是測量蛋白質表達的最有力工具［26－28］。但也有其他技術(如強陽離子交換)用于唐氏綜合征的蛋白質檢測和分析［29］。Liu等［30］對妊娠18～22周產前診斷高危唐氏綜合征者行羊膜穿刺術檢測羊水細胞中的蛋白質水平，結果顯示，唐氏綜合征羊水細胞18例，染色體正常羊水細胞20例;并采用雙向凝膠電泳和電子噴霧質譜進行蛋白質組學分析發現了41個差異蛋白，在唐氏綜合征羊水細胞中有6種蛋白質(鈣黏蛋白、核磷蛋白、延伸因子－1β、組織蛋白酶D、血小板活化因子乙酰水解酶IB亞基β和14－3－3蛋白β/α)表達水平顯著上調。免疫印跡法證實，核磷蛋白和組織蛋白酶D在唐氏綜合征羊水中高表達;此外，基因劑量效應是導致唐氏綜合征表型不同的原因之一，由于基因數量較大，很難清楚地了解位于第21號染色體上的基因與唐氏綜合征表型之間的聯系［31］。這些蛋白質都不是由第21號染色體上的基因編碼，唐氏綜合征由減數分裂不分離(約占95%)和體細胞有絲分裂錯誤(約占5%)所致［32］。

3.3 臍血特異性蛋白質篩選 臍血由全血中的所有元素(紅細胞、白細胞、血漿和血小板)組成。通常認為，最接近疾病原發部位標本(臍血和胎盤細胞、組織和體液)中的潛在生物標志物水平最高，故通過臍血檢測可診斷多種妊娠期胎兒疾病。文錦麗等［33］應用同位素標記相對和絕對蛋白定量法篩選出506種唐氏綜合征胎兒臍血差異表達蛋白質，其中24中蛋白質的表達水平比較差異有統計學意義，16種蛋白質表達水平上調，8種蛋白質表達水平下調，以基質蛋白－3、胸腺肽β10和骨橋蛋白變化最明顯。

臍血取材相對困難，但可直接反映胎兒蛋白表達的差異。Sui等［34］采用同位素標記相對和絕對定量技術與基因本體論分析研究6例唐氏綜合征孕婦和11名健康孕婦臍血蛋白水平的變化，結果顯示，與唐氏綜合征相關的蛋白質有19種，其中13種表達上調、6種表達下調，結合相關研究結論明確載脂蛋白E、補體因子B、淀粉樣蛋白P成分、Matrin－3和骨橋蛋白5種蛋白質與唐氏綜合征相關，且前3種蛋白質在唐氏綜合征中顯著上調。

3.4 尿液標志物的篩選 尿液和尿多肽是潛在疾病生物標志物的重要來源。目前可檢測到的尿液蛋白質和多肽數量超過10萬，且仍在增多［35］。在健康人中，70%的尿多肽/蛋白來自腎臟和尿路，其余30%的尿多肽/蛋白由腎小球血液超濾產生［36］，因此，尿液不僅能反映泌尿生殖系統的信息，還可能反映遠處器官的信息。Iles等［37］運用電子噴霧質譜技術發現，唐氏綜合征組尿液在11 000～12 000質譜掃描范圍(m/z)存在一個額外質譜峰，而6 000～8 000 m/z的質譜強度降低。根據上述特點，可辨別妊娠12～14周8例唐氏綜合征樣本與39例正常樣本，但其對妊娠15～17周時唐氏綜合征樣本的辨別力較差，僅辨別出10個唐氏綜合征樣本中的7個。可見，應用尿液樣本篩查唐氏綜合征的檢出率較高，假陽性率較低。Shan等［38］用弱陽離子交換磁珠對23例唐氏綜合征孕婦和30名核型正常孕婦的尿液進行電子噴霧質譜分析，兩組6種多肽的水平發生了顯著變化，其質譜掃描范圍分別為1 022.1、1 032.1、1 099.5、1 155.9、1 306.6和2 365.6 m/z;以上述候選多肽為基礎，建立唐氏綜合征與對照組分類模型的靈敏度為95.7%，特異度為70.0%，受試者工作特征曲線下面積為0.909(95%CI 0.835～0.984)。1 099.5 m/z和1 155.9 m/z的多肽峰分別為α1抗胰蛋白酶和熱激蛋白β1的部分序列，為胎兒唐氏綜合征產前篩查無創性生物標志物的發現和開發提供了可能的方向。

3.5 胎盤特異性蛋白質的篩選 胎盤是妊娠期間多種蛋白質和細胞因子變化的來源，對于胎盤組織蛋白質表達情況的研究既基礎又直觀，并可避免母體外周血細胞對研究結果的干擾。閆麗宇等［39］采用二維熒光差異凝膠電泳技術在10例唐氏綜合征孕婦胎盤組織中發現352個差異表達蛋白質點，其中有統計學意義的蛋白質點為56個，對其三維豐度比值在1.5倍以上的17個差異蛋白質點行質譜鑒定，其中12個蛋白質點上調，5個蛋白質點下調;最終確定10種蛋白質可匹配，其中差異表達最明顯的4種蛋白質為銅鋅超氧化物歧化酶1、熱激蛋白27、內質網分子伴侶29、過氧化物酶6。

4 小 結

基于質譜和生物信息學技術，蛋白質組學研究已經成為發現生物標志物的有力平臺。新的生物標志物的發現有助于疾病診斷，并有望用于唐氏綜合征產前篩查和診斷。目前，蛋白質組學方法仍存在局限性，其所發現的候選標記的性能在不同研究或實驗室不能重現，且驗證候選標志物有效性的進一步研究有限。未來仍需要通過建立生物樣本處理的標準化程序、利用定量蛋白質組學技術提高重復性、結合生物信息學分析選擇最佳的生物標志物、擴大臨床驗證研究并加強多中心合作等方式對蛋白質組學的應用進行深入研究。