60Co-γ射線對日本囊對蝦誘變子代遺傳多樣性和生長的影響

劉 波，鄭雅友，李正良

(福建省水產研究所，福建 廈門 361013)

日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)是我國較重要的養殖蝦類之一，養殖過程中種質不斷衰退，病害頻發，其種質的優劣已經成為影響產業可持續發展的關鍵因素[1]。研究表明，水生生物對病害的易感和緩慢的生長與其群體較低的遺傳多樣性水平密切關系[2]。60Co-γ射線誘變在育種實踐和遺傳學研究中有著廣泛應用，已在農作物育種中被大量使用，并取得良好的經濟效益和社會效益[3]。但是，相關技術手段在水生生物遺傳選育的領域使用較少：劉曉等利用60Co-γ射線對成體長牡蠣進行了照射，研究了射線對長牡蠣生長的影響規律[4]；筆者記錄了60Co-γ射線對日本囊對蝦誘變不同實驗組的孵化率、存活率[5]，總體來說，現階段可查閱的相關文獻資料較少。本文主要探討了在不同誘變劑量下60Co-γ射線對日本囊對蝦誘變子代遺傳和生長的影響，采用AFLP分子標記技術從分子水平對各組誘變子代的遺傳差異進行分析，旨在為增加日本囊對蝦子代群體的遺傳多樣性水平提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 誘變子代的來源

日本囊對蝦的親本為性腺發育良好、處于繁殖期的個體，體長為23～27 cm，共75尾。誘變子代為親本經過60Co-γ射線照射后孵化的苗種，在土池中培育90 d后隨機采集各實驗組樣本(各30尾)進行體質量測量，并采集肌肉樣本，制備高質量大片段基因組DNA樣本(共40份)備用。

1.1.2 實驗器材

鈷60治療機：國產FCC8000型；PCR儀：Biometra公司的T3型；紫外分光光度計：Varian公司的Cary 50型；高壓電泳儀：BIO-RAD公司的PowerPac 3000型；垂直電泳槽：BIO-RAD公司的Sequi-Gen GT型；超凈工作臺：凈化設備工程有限公司的SW-CJ-1F型；臺式高速冷凍離心機：Eppendorf公司的5810R型；生物分析儀：Agilent公司的2100型。

1.1.3 試劑

Taq聚合酶(Fermentas公司)；GeneRuler 50 bp DNA Ladder(Fermentas公司)；組織/細胞DNA(小量)抽提試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)；AFLP Analysis SystemⅠ試劑盒(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 親蝦的處理及苗種培育

日本囊對蝦剪除眼柄后暫養于廈門市水產研究所前埔實驗場24 m2水泥池內，連同對照組在內共設置5個實驗組，每組15尾。親蝦性腺成熟后在廈門大學附屬第一醫院進行60Co-γ射線照射，誘變劑量為50、100、1 000、1 500 cGy，劑量率為3.4 cGy/sec。

收集照射后當天產卵親蝦的受精卵，放置于半噸桶，按照常規的對蝦苗種繁育技術規范培育，仔蝦達到P20階段時，將上述苗種以15尾/m2(根據網箱面積計算)的養殖密度放置于室外土池中，使用2.5 m×2.5 m×2.0 m的塑膠網箱(各實驗組均設置3個平行)在同一水體中培育3個月(使用相同品牌、相同餌料量進行培育)，每天投餌2次，各實驗組日投餌率均相同。

1.2.2 誘變子代基因組DNA的制備

各實驗組共隨機采集40尾誘變子代(每組8尾)，經過蒸餾水洗滌后，剪下肌肉組織約25 mg，在液氮中研磨成白色粉末。使用上海華舜生物工程有限公司的組織/細胞DNA(小量)抽提試劑盒進行基因組DNA的提取。提取出來的DNA通過紫外分光光度計測定DNA濃度，將各組DNA用超純水稀釋為10 μg/mL的模板DNA；瓊脂糖凝膠電泳和生物分析儀2100檢測DNA完整性。

1.2.3 AFLP反應

雙酶切：取基因組DNA 100 ng，加入EcoR1和Mse1兩種內切酶各1 U和相應的緩沖液，在37℃條件下反應2 h。酶切后在70℃下作用15 min使酶失活。

連接：在20 μL反應體系中，含有雙酶切后的模板DNA 10 μL、T4連接酶1 U，連接緩沖液10 μL，在20℃條件下反應2 h。連接反應產物取5 μL用TE稀釋10倍備用，其余部分-20℃保存。

預擴增反應條件如下：94℃ 2 min；(94℃ 30 s，56℃ 60 s，72℃ 60 s)×20 cycles；預擴增反應產物取3 μL用TE稀釋50倍備用，其余部分-20℃保存。

選擇性擴增反應條件如下：94℃ 2 min；(94℃ 45 s，65～56℃ 45 s，72℃ 90 s)×13個循環；(94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s)×23個循環；72℃ 2 min。

EcoR I 接頭(Adapter)：5’-CTCGTAGACTGCGTACC，CATCTGACGCATGGTTAA-’5。

Mse I 接頭(Adapter)：5’-GACGTGAGTCCTGAG，TACTCAGGACTCAT-’5。

預擴增引物(Pre-amplification primers)序列：E05’-GACTGCGTACCAATTC-3’M05’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’

選擇性擴增引物(Selective-amplification primers)序列：

E-ACA/M-CAG E-ACT/M-CAT

E-AGC/M-CTG E-AGA/M-CTT

E-AGA/M-CAG E-ACC/M-CAC

E-ACC/M-CTT E-AGG/M-CAC

E-ACA/M-CAA E-AAG/M-CAT

制膠：將玻璃板清洗干凈，用75%酒精擦洗一遍。在較長的玻璃板涂一層硅烷黏合劑。晾干后將兩塊玻璃板夾好，封住底邊。配制6%變性聚丙稀酰胺凝膠，灌膠。水平放置1 h等待凝膠凝固。

電泳：AFLP擴增產物在電泳前加入4μL上樣緩沖液，在PCR儀上95℃變性5 min，冰浴10 min。膠凝固后先進行預電泳，電泳時電壓2 000 V，功率70 W，電流55 mA。當凝膠溫度上升至50℃時，取4 μL變性好的樣品加入電泳槽中電泳。電泳功率70 W，電壓2 000 V 左右，電流55 mA，電泳大約1.5 h，電泳緩沖液為1×TBE。

染色：將凝膠冷卻5 min，然后浸泡在10%的乙酸中進行固定，置于水平搖床上振搖約30 min；取出凝膠，用預冷的蒸餾水沖洗2次，放入銀染液中，再置于搖床上振搖約30 min；取出凝膠，用預冷的蒸餾水沖洗2次，浸入顯色液中至顯出清晰的條帶，放入10%乙酸溶液中中止顯色，觀察并拍照。

1.2.4 數據的統計

當某一擴增片段出現時記為1，不出現時記為0，將AFLP指紋圖譜中分子量從50 bp到2 000 bp之間的條帶轉換成數字矩陣，根據Nei M等[6]和Lynch M[7]的計算公式，計算各個實驗組遷移率不同的擴增片段數目、多態性片段(譜帶)數目及其比例、組內和組間擴增片段的相似系數、組間的遺傳距離[8]等各項參數，并對誘變子代的擴增圖譜進行比對(組內和組間)，得到遺傳距離矩陣，通過擴增位點的數量、多態率等參數評估誘變組與對照組之間的遺傳結構。

遺傳距離等數據的有關計算公式如下：

相似系數 Sij=2Nij/(Ni+Nj)

(1)

遺傳距離 D=-ln S

(2)

多態率 p=x/r

(3)

式中Nij為群體i與j共有的片段數量，Ni、Nj分別為群體i與j各自具有的片段數量；S為相似系數；x為具有多態性的位點，r為擴增出來的總位點數。

數據通過Microsoft Excel 2007進行計算；利用UPGMA法進行聚類分析。

2 結果

2.1 誘變子代的AFLP擴增結果

本文共篩選了20對選擇性引物，并從中選擇了10對選擇性擴增引物對日本囊對蝦誘變子代5組40份模板DNA進行AFLP擴增，每個引物均能擴增出重復性良好的特定擴增產物，表現出一定程度的多態性。日本囊對蝦10對引物在分子量50 bp到2 000 bp之間共檢測出447個位點，其中多態位點299個，占66.9%。引物擴增的位點數為36～55個，平均44.7個。表1列出了10對選擇性擴增引物對誘變子代基因組DNA的擴增情況。PCR擴增產物進行變性聚丙稀酰胺凝膠電泳后的結果如圖1所示。

表1 選擇性擴增的引物序列及日本囊對蝦誘變子代基因組DNA的擴增情況

續表1

注：M為50 bp DNA Ladder；1～8為誘變組4(1 500 cGy)；9～16為誘變組3(1 000 cGy)；17～24為誘變組2(100 cGy)；25～32為誘變組1(50 cGy)；33～40為對照組。

2.2 誘變子代各實驗組遺傳相似系數及遺傳距離的分析結果

根據各位點擴增產物的有無按1、0進行統計，建立數據矩陣，計算遺傳相似系數、遺傳距離等參數，日本囊對蝦誘變子代各實驗組遺傳相似系數的變化范圍從0.873 7(誘變組2組內的統計結果)一直到0.894 7(誘變組4和對照組之間的統計結果)。經過單因素方差分析檢測其差異顯著性，發現這些數據差異并不顯著，從群體水平來看，日本囊對蝦的誘變子代與正常對照組相比(P>0.05)，并沒有顯著的遺傳差異。表2列出了日本囊對蝦對照組和各誘變組組內及組間的遺傳相似系數與遺傳距離數據，圖2為利用UPGMA法得到的遺傳距離聚類圖。

表2 日本囊對蝦誘變子代各實驗組的遺傳相似系數(上三角)和遺傳距離(下三角)

注：1為對照組；2為誘變組1(50 cGy)；3為誘變組2(100 cGy)；4為誘變組3(1 000 cGy)；5為誘變組4(1 500 cGy)。

2.3 誘變子代各實驗組生長的影響分析

隨機采集日本囊對蝦誘變子代各實驗組樣本各30尾，在電子分析天平上進行體質量稱量。實驗數據通過SPSS 19.0進行單因素方差分析(表3)，作圖在Microsoft Excel 2007進行。實驗數據表明對照組的生長是各實驗組中生長速度最快的一組，且對照組與誘變組4(1 500 cGy)的生長速度具有顯著性差異(P<0.05)。

表3 日本囊對蝦誘變子代在土池培育90 d各實驗組平均體質量

續表3

3 討論

輻射對生物遺傳的影響表現在多個方面，包括DNA單鏈斷裂、雙鏈斷裂、堿基的損傷、DNA與DNA交聯及DNA和蛋白質交聯等，能夠有效地增加種群的遺傳多樣性水平，結合人工選育技術可篩選出符合人們生產需要的新品種或新品系[9]。1927年Muller首次報道了X射線能夠誘導果蠅產生大量多變類型的突變，其后大量研究以農作物為對象開展起來[10]，現階段誘變育成的作物品種中使用60Co-γ射線輻照的占75.0%～84.2%[11]。現在，輻射開始被應用在水生生物的遺傳選育當中[12-13]。

AFLP即擴增片段長度多態性(Amplified fragments length polymorphism)技術，是當前檢測遺傳多樣性較有效的手段之一[14]，人們僅需要少量的DNA就可以提供極為豐富的遺傳信息。AFLP技術現已被廣泛應用于動、植物的種系與個體鑒別、基因定位克隆，以及種群遺傳結構與遺傳多樣性的研究[15-18]。本研究的AFLP擴增結果說明了AFLP是一種能夠有效檢測種群內遺傳差異的分子標記技術。

本文利用大量基因位點的遺傳信息研究輻射誘變引起的遺傳差異，根據Nei M等[6]的報道，當基因位點足夠多時僅用1個樣本代表這個分類單元得到的系統發育圖都是可信的。本文的研究結果表明，日本囊對蝦誘變子代各實驗組組內及組間的遺傳相似系數及遺傳距離的差異并不顯著(P>0.05)，利用UPGMA法對日本囊對蝦誘變子代各實驗組遺傳距離的平均值進行聚類分析，發現各實驗組之間遺傳距離的差異都小于0.01。但是，在每對引物擴增出的基因型(單個個體擴增譜帶的組合型式)在誘變組中發現有部分個體的基因型和其他個體的基因型具有較為明顯的差異，而在對照組中并沒有發現類似的現象。結合筆者已發表的有關日本囊對蝦在無節幼體階段的論文中相應遺傳相似系數和遺傳距離具有較為顯著的差異這一實驗現象來分析[5]，認為經過輻射誘變處理后產生變異的個體在生長過程中其體內的自我修復機制可能會對產生變異的基因序列進行修復，在無法修復時甚至可能造成個體的死亡。因此，結合人工選育技術對少數變異個體進行選擇以建立生物新品系，增加群體的遺傳多樣性以豐富種質資源，顯得尤為重要[19]。

日本囊對蝦誘變子代在土池培育90 d，各實驗組生長速度的研究結果發現，對照組的生長速度在各實驗組中最快，且對照組與誘變組4(1 500 cGy)的生長速度具有顯著性差異(P<0.05)。但是，對照組組內個體之間生長速度的差異就要明顯小得多(P>0.05)，沒有出現這種個體體質量差異懸殊的現象。

從分子水平上對生物遺傳物質的變異進行評估是一種研究60Co-γ射線輻射誘變效應的現代技術，為進一步研究生物的自我修復系統與遺傳變異之間平衡的生物學機制提供了方法[20]。本研究由于遺傳背景信息的缺乏，AFLP技術具有能夠快速有效地分析群體遺傳差異的特點，為本文提供了比較充分的分子生物學證據[21]。本研究證實將60Co-γ射線應用于日本囊對蝦的誘變育種，還需要解決經過誘變后的個體在生長過程中不斷進行修復、甚至死亡的問題，以保證能夠得到大量的變異個體，通過人工選育，從而為產業提供具有優良性狀的新品種或新品系。將來，可以進一步將特殊個體分子標記的條帶從凝膠上切割下來，進行DNA序列測定，并將其發展成為STS(Sequence target site)標記，結合人工選育手段，形成分子標記輔助選育技術，以期快速地對種群進行遺傳選育工作。