紅毛藻多糖的提取工藝優化及其抗氧化活性

吳云輝，閻光宇，余 蕾，張怡評，楊 婷，晉文慧

(1.廈門海洋職業技術學院，海洋生物學院，福建 廈門 361100； 2.自然資源部第三海洋研究所，海洋生物資源開發利用工程技術創新中心，福建 廈門 361005； 3.福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心，福建 廈門 361005)

紅毛藻(Bangiafusco-purpurea)俗稱紅發菜、牛毛藻、牛毛海苔，屬紅藻門(Rhodophyta)、原紅藻綱(Florideophyceae)、紅毛菜目(Bangiales)、紅毛菜科(Bangiaceae)、紅毛菜屬(Bangiaatropurpurea)植物。紅毛藻主產于莆田湄洲、南日島一帶海域，顏色褐紅，細如毛發，含有豐富的鈣質和各種維生素，年產量約為80～100 t(干重)。目前主要作為食品原料銷售，每噸紅毛藻的價格為(10～30)×104元，然而，關于紅毛藻精深加工產品尚未見到[1]。近年來，研究發現紅毛藻中含有豐富的多糖類成分，這種成分具有降血壓、降血脂、防止動脈粥樣硬化等多種生物活性[1-2]。海藻多糖的提取及活性研究一直是藻類資源研究與開發的熱點，但由于紅毛藻價格較高，關于紅毛藻多糖的提取工藝及開發應用的研究報道較少。本文對紅毛藻多糖提取工藝中的料液比、溫度、時間三個因素進行單因素實驗考察，并通過正交實驗優選最佳提取工藝，試制樣品，而后對其體外抗氧化活性進行評價，以期為紅毛藻多糖的進一步開發應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干紅毛藻，購自福建莆田南日鎮。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，分析純，Sigma公司；葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、水楊酸、雙氧水、七水硫酸亞鐵等試劑均為分析純，中國醫藥集團。

1.2 儀器

UH5300紫外-可見分光光度計，日本HITACHI公司；H1650-V離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；SQP電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；QL-901漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HH-ZK2恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限公司；DHG-9030A電熱鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；DFT-200粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖含量測定方法

精密稱量葡萄糖，用水配制成0.1 mg/mL標準溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標準溶液置于20 mL具塞試管，加水至1.0 mL，配成 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL系列葡萄糖標準溶液，再依次加入1.0 mL 5%苯酚水溶液(g/W)和5 mL濃硫酸，每個樣品加水補足至總體積10 mL，渦旋混勻后于30℃水浴反應20 min，之后在 490 nm 測定吸光度[2]，以吸光度為縱坐標、葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.2 紅毛藻多糖提取

將干燥的紅毛藻用粉碎機粉碎，過篩(40目)。稱取紅毛藻粉末1.0 g，置于100 mL三角燒瓶中，按照料液比1∶40(W/V)加入40 mL蒸餾水后，于80℃水浴加熱提取2.0 h，紗布過濾，離心取上清液，量取濾液體積并測定吸光度以計算紅毛藻多糖提取量。

1.3.3 提取液中多糖含量的測定

取紅毛藻多糖提取液0.5 mL，按照1.3.1方法依次加入1.0 mL 5%苯酚水溶液(g/V)和5 mL濃硫酸，加水補足至10 mL，渦旋混勻，于30℃水浴反應20 min后，在490 nm 測定吸光度[3]，代入葡萄糖標準曲線，求算提取液濃度，并計算提取液中紅毛藻多糖提取量。

多糖提取量(mg/g)=M1×V1/M2

(1)

式(1)中，M1：從標準曲線上計算出樣品溶液的含量(mg/mL)；M2：取樣量(g)；V1：樣品定容體積(mL)。

1.3.4 紅毛藻多糖提取單因素實驗

以料液比、提取溫度、提取時間作為考察因素，以紅毛藻多糖提取量為指標進行單因素實驗。

1)考察料液比對紅毛藻多糖提取量的影響

精密稱取1.0 g紅毛藻粉末12份，每個條件平行3份，按照料液比1∶30、1∶40、1∶50 和 1∶60(W/V)，分別依次加入 30、40、50、60 mL的蒸餾水，在80℃水浴條件下提取2.0 h，按照1.3.1方法每組平行測定3次。

2)考察提取時間對紅毛藻多糖提取量的影響

精密稱取 1.0 g紅毛藻粉末12份，每個條件平行3份，分別加入40 mL(料液比1∶40)蒸餾水，于80℃水浴條件下提取，再分別于0.5、1.0、1.5、2.0 h時停止提取，離心取上清液，按照1.3.1方法每組平行測定3次。

3)考察提取溫度對紅毛藻多糖提取量的影響

精密稱取 1.0 g 紅毛藻粉末12份，每個條件平行3份，分別加入 40 mL(料液比1∶40)蒸餾水，并分別于70、80、90、100℃下提取1.5 h，離心取上清液，按照1.3.1方法每組平行測定3次。

1.3.5 紅毛藻多糖提取工藝優化

在單因素實驗的基礎上，以紅毛藻多糖提取量為考察指標，以提取溫度、提取時間、料液比為因子進行L9(34)正交實驗，以確定紅毛藻多糖的最佳提取工藝。

表1 正交實驗因素水平表

1.3.6 提取工藝驗證

為驗證建立的最佳提取工藝，本實驗進行3次平行實驗。稱取1.0 g紅毛藻3份，按照建立的最佳提取工藝進行提取，并按照1.3.1方法平行測定3次。

1.3.7 紅毛藻多糖的抗氧化活性實驗

1)紅毛藻多糖清除DPPH自由基的能力測定

分別用5支7 mL離心管移取0.04 mg/mL DPPH-乙醇溶液1.5 mL，再依次加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL紅毛藻多糖溶液(濃度為2 mg/mL)，并用水補足至3.0 mL，靜置30 min后在517 nm處測定溶液吸光度，計算紅毛藻多糖對DPPH自由基的清除率[4-5]。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

(2)

式(2)中，A0為未加紅毛藻多糖溶液DPPH溶液的吸光度；A1為加紅毛藻多糖溶液后DPPH溶液的吸光度；A2為紅毛藻多糖溶液的吸光度。

2)紅毛藻多糖清除羥基自由基的能力測定

分別向5支離心管加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL紅毛藻多糖溶液(濃度為5 mg/mL)，用蒸餾水補足至1.0 mL，然后每支離心管分別加入0.3 mL 6 mmol/L FeSO4、1.5 mL 6 mmol/L水楊酸，搖勻，最后加入30% H2O2啟動反應，靜置10 min后在510 nm處測定吸光度，計算紅毛藻多糖對羥基自由基的清除率[6-7]。

清除率(%)=(A0-A1+A2)/A0×100

(3)

式(3)中，A0為未加紅毛藻多糖溶液時羥基溶液的吸光度；A1為加紅毛藻多糖溶液后羥基溶液的吸光度；A2為紅毛藻多糖溶液的吸光度。

2 結果

2.1 多糖標準曲線測定

根據1.3.1方法得到回歸曲線方程，如圖1所示，Y=9.945 0X-0.010 1(Y為吸光值，X為葡萄糖濃度)，相關系數R2=0.999 5。

2.2 紅毛藻多糖提取單因素實驗

2.2.1 料液比對紅毛藻多糖提取量的影響

在水浴溫度80℃、提取時間2.0 h的條件下，分別以料液比1∶30、1∶40、1∶50 和 1∶60(W/V)提取紅毛藻多糖，結果如圖2所示。由圖2可知，當料液比從1∶30到1∶50，紅毛藻多糖的提取量呈上升趨勢，以1∶30到1∶40上升的趨勢較大，之后上升趨勢較慢，基本上趨于平衡狀態。這主要是因為隨著料液比的增加，溶解的多糖也增多，且在一定范圍內增加提取液的體積可以增大溶劑與提取物的接觸面積，使水溶性的多糖能夠較多地溶出，于是產生了隨水量增加而多糖提取量升高的現象，但是當料液比增加到可以溶解所有能被提取出的多糖時，繼續增加水量，所溶解的多糖也不會再增加，出現了繼續加水而多糖提取量趨于平穩的現象。考慮后續多糖提取液濃縮干燥等能耗因素，料液比以1∶40為最佳。

2.2.2 提取時間對紅毛藻多糖提取量的影響

在水浴溫度80℃、料液比1∶40的條件下，分別于0.5、1.0、1.5、2.0 h時停止提取紅毛藻多糖，結果如圖3所示。由圖3可以看出，隨著提取時間的延長，多糖提取量在0.5 h到1.5 h逐漸增加，但在1.5 h 到2.0 h過程中，多糖的提取量基本不增加。這可能是因為在提取初期，多糖能夠被不斷提取出來，但是隨著時間延長，多糖提取量逐漸升高而不再有明顯的變化，所以盡管時間延長也無法再提高多糖提取量。同時，也有可能是加熱過久導致部分多糖降解被破壞，從而導致提取量稍微下降。因此，提取時間選擇1.5 h 為最佳。

2.2.3 提取溫度對紅毛藻多糖提取量的影響

在料液比1∶40、提取時間1.5 h的條件下，分別于70、80、90、100℃下提取紅毛藻多糖，結果如圖4所示。由圖4可知，隨著提取溫度的升高， 多糖含量逐漸增大， 在90℃后多糖含量略微減少。這是因為多糖的溶解度隨著溫度的升高而升高，使得在一定范圍內多糖提取量隨溫度升高而升高，但是當溫度繼續升高時，由于多糖的熱不穩定性導致其發生分解，且溫度過高會消耗能量，多糖提取量呈下降趨勢。考慮到經濟成本和防止多糖在高溫下遭受破壞，提取溫度不宜過高，選擇最佳提取溫度為90℃。

2.3 紅毛藻多糖提取工藝優化

在單因素實驗的基礎上，以紅毛藻多糖提取量為考察指標，以提取溫度、提取時間、料液比為因子進行L9(34)正交實驗，以確定紅毛藻多糖的最佳提取工藝，正交實驗結果見表2、表3。

表2 L9(34)正交實驗結果

表3 正交實驗方差分析表

由表2正交實驗結果直觀分析可得，提取溫度和提取時間對紅毛藻多糖的提取量影響較顯著，而料液比對紅毛藻多糖的提取量影響最小。通過優化的最佳提取工藝為A3B3C2，即以料液比為1∶40、在90℃下提取2.0 h為最佳提取工藝。通過表3正交實驗方差分析結果進一步表明，提取溫度與提取時間對紅毛藻多糖的提取量起主要作用。

2.4 提取工藝驗證

從表4提取工藝驗證實驗結果可知，3份樣品的紅毛藻多糖的平均提取量為77.57 mg/g，RSD為2.80%，表明所建立的紅毛藻多糖提取工藝穩定可行。

表4 驗證實驗

2.5 紅毛藻多糖的抗氧化活性實驗

2.5.1 紅毛藻多糖清除DPPH自由基的能力測定

由實驗結果(圖5)可知隨著樣品濃度的增加，樣品的清除率也在不斷增加，說明紅毛藻多糖清除DPPH自由基呈劑量依耐型關系。根據樣品的濃度與清除率曲線結果可得，紅毛藻多糖清除DPPH自由基的IC50值為0.36 mg/mL。

2.5.2 紅毛藻多糖清除羥基自由基的能力測定

由實驗結果(圖6)可知紅毛藻多糖對羥基自由基的清除率隨著濃度的增加而提高，表明紅毛藻多糖濃度與羥基自由基的清除率呈正相關。根據樣品的濃度與清除率曲線結果可得紅毛藻多糖清除羥基自由基的IC50值為0.65 mg/mL。

3 討論

海藻多糖是藻類植物中重要的組成成分之一，約占干重的20%～70%，它是一類混合物，是海藻細胞間和細胞內所含的各種高分子碳水化合物的總稱[8]。研究表明，海藻多糖具有廣泛的生物學活性，包括抗病毒、抗腫瘤、免疫調節、降血脂和降血糖等[9-13]，因而其有望被開發成為保健品或者藥品，為實現產業可持續發展提供有益的參考[14]。

本實驗通過單因素實驗并結合正交實驗設計優化紅毛藻多糖的提取工藝，最后確定紅毛藻多糖最佳提取工藝為料液比1∶40、在溫度為90℃下提取2.0 h。抗氧化活性研究表明紅毛藻多糖能有效清除DPPH自由基，其 IC50值為0.36 mg/mL；紅毛藻多糖清除羥基自由基的IC50值為0.65 mg/mL。本研究可為紅毛藻多糖的高值化開發應用提供理論依據，也為海藻多糖的應用前景[15]提供了理論參考。