橡膠樹HbDHAR2基因克隆及表達分析

李雙江，馮成天，胡義鈺，袁 坤，劉進平，王真輝，劉 輝

(1.海南大學 熱帶作物學院，海南 ?？?570228；2.中國熱帶農業科學院 橡膠研究所，農業農村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，省部共建國家重點實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，海南 海口 571101)

谷胱甘肽S-轉移酶(Glutathione S-transferase，GST)是一類由超基因家族編碼的多功能酶，在動植物和微生物中廣泛存在[1-3]。其通過催化還原型谷胱甘肽與內源和外來的各種有害物質共價結合，形成復合物，隔離在液泡或轉移到質外體，從而將其降解排出，降低其對細胞的損害[1，3-4]。植物GSTs可分為14類：Phi (GSTF)、Tau (GSTU)、DHAR (Dehydroascorbate reductase，脫氫抗壞血酸還原酶，EC 1.8.5.1)、EF1Bγ (Elongationfactor1Bγ)、GHR (Glutathionyl hydroquinone reductase)、Hemerythrin (GSTH)、Iota (GSTI)、Lambda (GSTL)、Theta (GSTT)、Zeta (GSTZ)、mPGES-2 (Microsomal prostaglandin E synthasetype 2)、TCHQD (Tetrachloro hydroquinone dehalogenase)、Ure2p和Metaxin[5]。其中，Phi、Tau、DHAR和Lambda類是植物所特有的[6]。DHAR是抗壞血酸(Ascorbic acid，AsA)-谷胱甘肽循環中的關鍵酶之一。植物DHAR具有2個典型的結構域：相對保守的GST N-端結構域和變化的GST C-端DHAR結構域，其中N-端結構域是由α螺旋和β折疊組成的類硫氧還原蛋白結構域，C-端DHAR結構域主要由多個α螺旋組成[5，7]。此外，在其N-端結構域中含有一個保守的催化模體CPFS/C[8]。DHAR N-端結構域具有谷胱甘肽特異結合位點，能以谷胱甘肽為還原性底物，催化脫氫抗壞血酸還原成AsA。DHAR能促進AsA再生，對維持植物細胞內AsA的動態平衡具有重要意義[9-10]。

1952年，Yamaguchi和Joslyn[11]首次從豌豆中分離純化出DHAR。此后，陸續從許多植物中克隆鑒定了DHAR基因，如擬南芥[12]、水稻[13]、玉米[14]和茶樹[15]等。研究表明，DHAR除調控植物體內AsA動態平衡外，還調控著植物的活性氧水平、氣孔開閉、光合作用和生長發育[16-19]。此外，越來越多的研究證實，DHAR基因在植物非生物脅迫抗性中發揮重要作用[10，20]。Ushimaru等[21]將水稻OsDHAR1轉入擬南芥發現，鹽脅迫下轉基因株系的發芽率和生長情況顯著優于非轉基因對照，而低溫脅迫下轉基因株系與非轉基因對照表型并無明顯差異，表明超量表達OsDHAR1能顯著提高轉基因植株對鹽脅迫的抗性，卻未能提高抗寒性。但Le Martret等[22]的研究表明，在煙草中超量表達OsDHAR1同時提高了轉基因植株對低溫和鹽脅迫的抗性。此外，在擬南芥中超量表達油菜BrDHAR基因也顯著提高了轉基因植株的抗寒性[23]。Eltayeb等[24]將擬南芥AtDHAR1基因轉入煙草，發現轉基因植株對臭氧、干旱、高鹽等非生物脅迫的抗性顯著提高。張珊[25]從小麥中克隆了DHAR基因，并在小麥中超量表達該基因，發現轉基因植株的DHAR酶活性較非轉基因植株顯著增加，同時提高了小麥對干旱和氧化脅迫的抗性。

橡膠樹(Heveabrasiliensis)作為主要的熱帶經濟作物，是重要工業原料和戰略物資天然橡膠的主要來源。我國主要在海南、云南和廣東種植橡膠樹。這些地區地處熱帶北緣，屬于非傳統植膠區，低溫、干旱、臺風等非生物脅迫嚴重制約著天然橡膠產業發展。分離鑒定抗逆基因是橡膠樹非生物脅迫抗性遺傳改良的基礎。DHAR基因在植物非生物脅迫抗性中起著重要作用，但迄今為止并未見有關橡膠樹DHAR基因的研究報道。本研究克隆了橡膠樹HbDHAR2基因，進行了生物信息學和表達模式分析，以期為進一步探究該基因在橡膠樹非生物脅迫應答中的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料與處理

本研究所用的成熟葉、衰老葉、嫩梢、雌花、雄花、膠乳和樹皮組織樣品采自中國熱帶農業科學院試驗農場六隊的橡膠樹品種熱研7-33-97，植株2003年種植，2011年開始割膠。根組織樣品采自熱研7-33-97組培苗，植株已移栽培養8個月。樣品采集時，將3株植株的組織樣品等量混合作為1次生物學重復，每組織樣品采集3次生物學重復。

選取移栽培養8個月的熱研7-33-97組培苗健康植株，進行甲基紫精(MV)、過氧化氫(H2O2)、乙烯利(ETH)、水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、低溫、干旱和高鹽處理。其中，MV、ABA和MeJA處理濃度均為200 μmol/L，SA處理濃度為5 mmol/L，ETH處理濃度為10 mmol/L，H2O2處理濃度為20 mmol/L。處理時，將溶液均勻噴灑于植株所有葉片正反面。同時，以噴灑清水的植株作為對照組。低溫、PEG (Polyethylene glycol)誘導的干旱及NaCl誘導的鹽脅迫處理參照劉輝等[26-27]的方法。4 ℃低溫處理在人工氣候箱中進行，處理時光照時間為16 h，強度為600 μmol/(m2·s)。PEG6000處理的濃度為20%，NaCl處理的濃度為400 mmol/L，處理時將植株從育苗袋中取出，洗凈栽培基質，根部浸沒于PEG6000或NaCl 溶液中。在處理0，3，6，12，24，48 h時采集植株第2，3片葉，每處理時間點設3次生物學重復，每重復取自3株植株。樣品采集后液氮凍存，用于RNA提取。

1.2 總RNA提取、反轉錄及目標基因克隆

采用北京百泰克生物技術有限公司的通用植物總RNA提取試劑盒提取葉、嫩梢、雌花、雄花、樹皮和根等組織樣品總RNA，采用天根生化科技有限公司的多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取膠乳總RNA，具體提取方法參照試劑盒說明書。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa)去除質量檢測合格RNA樣品中的基因組DNA，并反轉錄合成第一鏈cDNA。具體實施方法參照試劑盒說明書。

通過對橡膠樹樹皮轉錄組測序數據的注釋分析，發現一DHAR基因scaffold0276_83160，以此序列為探針在NCBI數據庫中進行Blast，獲得該基因的全長序列，GenBank登錄號為XM_021823366.1。利用在線程序Primer 3 (http：//primer3.ut.ee/)設計擴增該基因完整ORF (Open reading frame，開放閱讀框)的引物，正向和反向引物序列分別為5′-TTCCGCTAACCAAGATCACA-3′和5′-TGACAACCACTGGCATACATC-3′。PCR 擴增目標基因，使用的模板為葉片cDNA，PCR反應體系如下：5 μL 5×TransStart?FastPfu Buffer，0.5 μL TransStart?FastPfu DNA Polymerase (2.5 U/μL)，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，正、反向引物各0.5 μL(10 μmol/L)，2 μL cDNA模板，14.5 μL 滅菌雙蒸水。PCR程序設置如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，并回收純化目標片段與北京全式金生物技術有限公司的pEASY?-Blunt Simple Cloning Vector連接。連接產物熱激轉化Trans1-T1 Phage Resistant感受態細胞，并均勻涂于含卡那霉素100 mg/L的LB固體培養基上，37 ℃過夜培養，挑選PCR檢測為陽性的單克隆送鉑尚生物技術(上海)有限公司進行測序。

1.3 生物信息學分析

利用SoftBerry (http：//linux1.softberry.com/)數據庫中的FGENESH程序預測基因ORF和編碼的氨基酸序列；使用Compute pI/Mw (http：//web.expasy.org/compute_pi/)分析HbDHAR2的分子量和等電點；分別采用CDD (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、TMHMM Server v. 2.0 (http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和ProtScale (http：//web.expasy.org/protscale)預測HbDHAR2的保守結構域、跨膜結構域及親/疏水性；通過NCBI BlastP獲取與HbDHAR2同源的其他植物DHAR蛋白序列，利用Clustal Omega (http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進行多序列比對，并利用MEGA 10.0軟件中Neighbor-Joining算法構建系統進化樹，Bootstrap重復次數設為1 000。

1.4 實時熒光定量PCR

使用Primer 3設計實時熒光定量PCR (qPCR)分析的HbDHAR2特異引物，正向引物：5′-GATCTCAGGGTGGGAGCCTA-3′，反向引物：5′-CCACTGGCATACATCTCGGT-3′。內參基因選用HbUBC4，正向引物：5′-TCACCCTGAACCTGATAGCC-3′，反向引物：5′-TTTCTTTGGTGACGCTGCAA-3′。qPCR 在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀上進行，熒光染料采用的是TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa)，具體反應體系和反應條件參照試劑說明書實施。采用2-ΔΔCt計算基因相對表達量，結果以3次生物學重復的平均值±標準差表示。使用Excel 2007程序處理試驗數據，并制作圖表。差異顯著性分析采用SAS 8.1軟件，顯著性檢驗水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 HbDHAR2基因克隆及序列分析

從橡膠樹HeveaDB數據庫(http：//hevea.catas.cn/home/index)獲取scaffold0276_83160序列，并在NCBI數據庫中進行Blast。比對結果表明，該基因序列與GenBank數據庫中的XM_021823366.1序列相同。根據該序列設計特異引物，以橡膠樹品種熱研7-33-97葉片cDNA為模板，采用PCR克隆了該基因(圖1)。測序分析表明，擴增獲得的基因序列長785 bp，與參考序列完全一致。序列比對結果表明，該基因與其他植物DHAR2基因具有很高的序列一致性，故將該基因命名為HbDHAR2。

基因預測結果表明，HbDHAR2基因ORF長度為639 bp，編碼212個氨基酸。預測HbDHAR2蛋白分子量為23.82 ku，理論等電點為5.69。蛋白序列比對及保守結構域預測表明，HbDHAR2蛋白屬于GST超家族中的DHAR亞類。HbDHAR2含有2個保守結構域：GST N-端結構域和GST C-端DHAR結構域，分別位于第19-88位和89-209位氨基酸(圖2)。此外，在其GST N-端結構域中含有一CPFS/C保守模體(圖2)。

TMHMM Server v.2.0預測結果表明，HbDHAR2蛋白不具有跨膜結構域。ProtScale預測結果如圖3所示，HbDHAR2氨基酸序列的第9位的丙氨酸分值最大，為1.833，是疏水性最強的氨基酸；第117位的天冬氨酸分值最小，為-2.600，是親水性最強的氨基酸。HbDHAR2氨基酸序列預測分值為負值的氨基酸數量明顯高于分值為正值的氨基酸數量，表明HbDHAR2為親水性蛋白。

2.2 HbDHAR2蛋白系統進化分析

對橡膠樹HbDHAR2、小麥TaDHAR2、水稻OsDHAR1、擬南芥AtDHAR2、棉花GhDHAR2、胡楊PeDHAR2、麻風樹JcDHAR2、蓖麻RcDHAR2和木薯MeDHAR2蛋白進行多序列比對分析，結果顯示，所分析的DHAR蛋白之間的一致性都在67%以上，說明DHAR在不同植物中較為保守(圖2)。HbDHAR2與木薯MeDHAR2 (XP_021624573.1)氨基酸序列一致性最高，達91.94%。其次是蓖麻RcDHAR2 (XP_002523030.1)，一致性為85.78% (圖2)。進一步構建HbDHAR2與所選其他植物DHAR蛋白的進化樹，發現這些DHAR蛋白可分為2組。麻風樹JcDHAR2、甜橙CsDHAR2、陸地棉GhDHAR2、雷蒙德氏棉GrDHAR2、榴蓮DzDHAR2、亞洲棉GaDHAR2、木槿HsDHAR4聚為一組；橡膠樹HbDHAR2與其他8個DHAR蛋白聚為一組，該組又可進一步分為2個亞組。HbDHAR2與木薯MeDHAR2、蓖麻RcDHAR2聚在同一亞組，表明三者親緣關系最近(圖4)。

2.3 HbDHAR2基因的組織表達模式

如圖5所示，在橡膠樹根、膠乳、樹皮、衰老葉、成熟葉、嫩梢、雄花和雌花中均檢測到HbDHAR2基因的表達，但在各組織中的表達量不同，其中，在嫩梢和雌花中的表達量較高，其次是成熟葉，而在膠乳和根中的表達量較低(圖5)。比較HbDHAR2基因在衰老葉和成熟葉的表達發現，HbDHAR2在衰老葉中的表達量顯著低于成熟葉(P<0.05)。

2.4 激素處理對HbDHAR2基因表達的影響

對照組中，HbDHAR2基因的表達水平基本是穩定的，僅在12 h出現明顯下調。ETH、MeJA、SA及ABA處理后，不同時間點葉片中HbDHAR2基因的表達量均顯著高于相應對照(P<0.05)，說明HbDHAR2的表達受這些激素誘導(圖6)。其中，ETH和MeJA處理后，HbDHAR2基因的表達變化趨勢相似，均以在處理48 h的表達量最高，分別為對照的9.4，7.6倍，表明在ETH和MeJA處理后期HbDHAR2的響應更強烈。SA處理能快速提高HbDHAR2基因的表達，在處理3 h表達量便達到最高，為對照的7.6倍。ABA處理也能迅速誘導HbDHAR2基因的表達，也以處理3 h的表達量最高，為處理前的6.7倍；此后HbDHAR2基因的表達有所下降，而處理48 h又有所上升，接近3 h的表達量。SA和ABA處理后，HbDHAR2表達量迅速增加，在3 h就達到最大值，表明HbDHAR2基因能快速響應SA和ABA。以上結果表明，ETH、MeJA、SA和ABA處理均能誘導HbDHAR2基因的表達，其中ETH和MeJA處理的誘導效果更明顯。

2.5 非生物脅迫下HbDHAR2基因的表達變化

由圖7可知，低溫脅迫下，葉片中HbDHAR2基因的表達呈先升高后回落趨勢，以處理3 hHbDHAR2的表達量最高，是處理前的13.3倍；處理3 h后，HbDHAR2的表達水平逐漸回落，但在3～24 h階段均顯著高于處理前；處理48 h，HbDHAR2的表達量基本回落到處理前正常水平。PEG誘導的干旱和MV誘導的氧化脅迫下，HbDHAR2基因的表達變化趨勢相似，處理3 h的表達量較處理前顯著上升，6 h明顯回落，但處理12 h，表達量再次顯著上升，達到最大值，分別為處理前的10.7，6.1倍；處理24 h后，HbDHAR2的表達水平逐步回落，但各處理時間點HbDHAR2的表達量均顯著高于處理前。NaCl誘導的高鹽脅迫下，HbDHAR2基因的表達量在處理3，6，24 h時均顯著高于處理前，其中，處理3，24 h，HbDHAR2基因的表達水平接近，是處理前的3.4倍；而處理48 h，HbDHAR2基因的表達量明顯下調，顯著低于處理前。H2O2誘導的氧化脅迫下，各處理時間點HbDHAR2基因的表達量均顯著高于處理前，其中，處理48 h，HbDHAR2基因的表達量最高，是處理前的4.3倍。上述結果表明，HbDHAR2基因的表達受低溫、干旱、高鹽和氧化脅迫的誘導，其中受低溫和干旱脅迫的誘導表達更強烈。

3 討論

本研究從橡膠樹中克隆了HbDHAR2基因，保守結構域和序列比對分析表明，HbDHAR2具有典型的GST N-端結構域和GST C-端DHAR結構域，與其他植物DHAR2或DHAR2-like蛋白具有較高的一致性。根據Lallement等[5]對植物GST超家族的分類，HbDHAR2屬于GST超家族中的DHAR亞類。在HbDHAR2的GST N-端結構域含有CPFS/C保守基序，該保守基序是所有植物DHAR都具有的[7]。研究表明，CXXS/C基序在氧化還原酶中非常保守，其對于酶氧化還原功能的發揮至關重要[28]。DHAR能將氧化型AsA還原為還原型AsA，是植物AsA再生的關鍵酶，也是植物體內一種非常重要的抗氧化酶[9-10，18，20]。CXXS/C保守基序可能在DHAR行使功能中扮演著重要角色。

AsA是一種重要的抗氧化劑，能清除植物在光合作用、生物及非生物脅迫等過程中產生的活性氧，從而保護植物細胞免受傷害。除此之外，AsA還調控著植物的生長發育[29]。研究表明，DHAR基因能通過調節AsA水平調控植物細胞的分裂、分化及快速生長[17，30]。本研究通過組織表達譜分析發現，HbDHAR2在橡膠樹嫩梢中的表達量最高。嫩梢生長快速，細胞分裂活動旺盛，HbDHAR2在該組織中高表達，推測其可能參與調控枝梢生長發育。此外，HbDHAR2在雌花中也具有很高的表達量，其可能參與了雌花發育調控。Chen和Gallie[17]的研究表明，降低DHAR的表達會加速葉片的衰老，而提高DHAR的表達能減緩葉片衰老。與此相符，本研究發現衰老葉片中HbDHAR2基因的表達水平顯著低于成熟葉片，這表明HbDHAR2可能參與調控橡膠樹葉片的衰老。

激素在植物對逆境的適應中起著重要作用，其中調控植物生物或非生物脅迫響應的主要激素有ABA、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)和SA[31]。當植物受到脅迫刺激后，會激活這些激素信號途徑，從而調節下游基因的表達，以抵御逆境脅迫。旨為明確HbDHAR2基因是否受這些激素調控，筆者分析了該基因在ABA、ETH、MeJA和SA處理后的表達變化。結果表明，這些激素處理均能誘導HbDHAR2的表達。ABA是植物抵御非生物脅迫的關鍵信號分子。在玉米中，ABA處理會快速上調ZmDHAR1基因的表達[14]。與之相似，本研究也發現ABA處理能迅速誘導HbDHAR2的表達，推測HbDHAR2可能通過依賴 ABA的信號途徑響應非生物脅迫。除調控非生物脅迫響應外，JA 、SA和ET還是調節植物抗病反應的關鍵信號分子[31]。HbDHAR2的表達受MeJA、SA和ETH誘導，預示著該基因可能參與了橡膠樹對病原菌等生物脅迫的應答。此外，ET對植物的生長發育，特別是植物的成熟和衰老起著非常重要的調節作用。ETH處理后期HbDHAR2具有很高的表達量，結合該基因在嫩梢中高表達而在衰老葉中低表達的特性，推測ETH處理后HbDHAR2的上調表達可能是植株為了延緩ETH誘導的衰老而采取的抵御措施。

非生物脅迫下，DHAR能催化生成更多的AsA，從而有效清除植物體內產生的過量活性氧，提高植物的抗逆性。眾多研究表明，植物在遭受非生物脅迫后，DHAR基因的表達會上調[14，15，25]。本研究也發現，低溫、PEG誘導的干旱、高鹽、MV和H2O2誘導的氧化脅迫均能誘導HbDHAR2的表達，而且在處理3 h就上調很高，這表明該基因能對多種非生物脅迫做出快速應答，HbDHAR2可能在橡膠樹響應非生物脅迫中發揮重要的作用。一些研究表明，超量表達DHAR基因能顯著提高轉基因植株的抗逆性，如水稻OsDHAR1[21-22]、油菜BrDHAR[23]、擬南芥AtDHAR1[24]、小麥DHAR[25]等。超量表達HbDHAR2是否也能提高橡膠樹對非生物脅迫的抗性還有待進一步的功能驗證分析。