鹿角靈芝三萜合成關鍵酶GaSQS基因的克隆與誘導表達

王丹丹，劉曉紅，宮遠航

(遼東學院 農學院，遼寧 丹東 118003)

鹿角靈芝(Ganodermaamboinense)隸屬于真菌界(Kingdom Fungi) 擔子菌綱(Basidiomycetes)多孔菌目(Polyporales)多孔菌科(Polyporaceae)靈芝菌屬(Ganoderma)，多生長在云南的無量山以及海南的尖峰嶺、吊羅山等地區，因其菌柄較長，常伴有多個鹿角狀分支，無菌蓋或偶見小菌蓋，表面具漆樣光澤、褐紅色或紫褐色；鹿角靈芝因生長環境條件變化(如控制CO2的濃度)而形成，自然條件下卻極為罕見[1]。鹿角靈芝作為靈芝中的名貴品種，具有抗腫瘤、抗衰老、抑制組織胺釋放、增強單核吞噬細胞系與NK細胞功能、護肝、抗HIV病毒以及調節免疫力的作用，其關鍵藥效成分為靈芝三萜和靈芝多糖；試驗證明，靈芝三萜類具有迅速提高免疫力的作用，表現在促進淋巴細胞增殖，提高巨噬細胞、NK細胞、T細胞的吞噬能力和殺傷力，并直接和間接毒殺腫瘤細胞[2]，同時能夠激活化療藥物難以殺死的G0期腫瘤細胞，進行單獨和聯合毒殺[3]；羊毛甾烷型四環三萜的靈芝提取物在研究中顯示出對肝惡性腫瘤細胞具有抑制作用，而對正常肝細胞并無抑制效果，其機理為快速降低細胞生長調控蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)的活力以及延緩應激活化蛋白激酶(Stress-activated protein kinase，SAPK)的激活[4]。

萜為種類最多的一類天然產物，是異戊二烯聚合物以及其衍生物的總稱，分子式為異戊二烯整數倍的烯烴類化合物[5]。萜類在不同物種的生命活動中具有不同的生理功能，如植物激素(脫落酸和赤霉素)、昆蟲保幼激素、光合色素(胡蘿卜素和葉綠素)、電子載體(質體醌和泛醌)、多糖合成介質(多聚異戊烯磷酸)以及生物膜成分(甾醇)，此外，萜類作為次生代謝產物也是鹿角靈芝的關鍵藥效成分[6]。

三萜類物質是由甲羥戊酸途徑合成(圖1)：首先合成活性異戊烯前體，即由三羧酸循環產生的乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)與乙酰乙酰輔酶A(Acetoacetyl-CoA)生成3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutary CoA，HMG-CoA)，后者還原生成甲羥戊酸(Mevalonic acid，MVA)，MVA經數步反應轉化成異戊烯基焦磷酸(Isopentenylpyrophosphate，IPP)，IPP再經硫氫酶(Sulphydryl enzyme)及異戊烯焦磷酸異構酶(IPP isomerase)轉化為二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)；IPP和DMAPP兩者均可轉化為半萜，在酶的作用下，頭尾相接聚合為牦牛兒焦磷酸(Geranyl pyrophosphate，GPP)，GPP經鯊烯合酶(Squalene synthetase，SQS)以法尼酯焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate，FPP)為底物，生成鯊烯，進而生成靈芝三萜[7]；可見，SQS是生成靈芝三萜的拐點，是催化兩分子法尼酯焦磷酸縮合產生鯊烯的關鍵酶，而鯊烯是生物合成三萜、甾醇、膽固醇等萜烯類重要物質的共同前體，所以SQS是靈芝三萜合成途徑的關鍵酶[8-9]。三萜類物質普遍存在于真核及原核生物的細胞質內，SQS是鹿角靈芝MVA途徑中的首個限速酶，目前，已在多個物種中成功克隆并表達，但關于鹿角靈芝三萜代謝調控及合成途徑關鍵酶基因SQS的克隆與表達分析尚未見報道[10]。

目前，對影響鹿角靈芝三萜類化合物含量的研究主要集中在培養基成分上，而合成途徑中關鍵酶基因和藥物誘導對靈芝三萜含量的影響未見報道[11]。靈芝三萜含量多少是衡量鹿角靈芝品質的重要指標；本研究參考靈芝(DQ494674.1)的三萜化合物合成關鍵酶基因SQS，設計引物，采用RT-PCR與RACE技術克隆鹿角靈芝SQS全長基因，命名為GaSQS基因。通過蛋白序列比對、結構域分析、蛋白網絡互作以及進化樹構建，分析調控靈芝三萜合成的關鍵酶基因GaSQS的特性，為深入研究GaSQS蛋白的功能，并最終解釋鹿角靈芝三萜合成途徑的分子機制奠定基礎；在鹿角靈芝深層發酵過程中添加外源茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)，采用qRT-PCR技術分析茉莉酸甲酯在鹿角靈芝生長發育不同時期對靈芝三萜含量誘導影響，有助于揭示鹿角靈芝三萜合成調控的分子機制，以期采用基因工程手段提高鹿角靈芝的藥用活性和商品價值打下良好的基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗菌株

鹿角靈芝由遼東學院生物產業研究所提供，鹿角靈芝接種于液體PDA培養基中(250 mL錐形瓶裝100 mL PDA培養基)，從試管斜面培養的菌株中，挑取5～6塊1 cm2菌絲接種到試驗培養基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養8 d，為了研究不同濃度MeJA對GaSQS基因表達的影響，采用乙醇為助溶劑，將MeJA配制成50，100，150，200，250，300 μmol/L，分別加入培養基中誘導12 h，另取一組不加MeJA為對照組[12]。每個處理3個生物學重復，取平均值。

1.2 總RNA提取

收集MeJA誘導后的新鮮菌絲，離心去除上清液，取60～100 mg置于液氮中研磨，研磨徹底成粉末狀，按照真菌總 RNA 快速抽提試劑盒(Fungal Total RNA Isolation Kit)步驟抽提鹿角靈芝總RNA，120 V、1%瓊脂糖電泳20 min，檢測RNA完整性[13]。以鹿角靈芝總RNA為模板，GaSQS1為引物(表1)，采用一步法 RT-PCR 擴增試劑盒(M-MuLV)生成cDNA第一鏈，為克隆鹿角靈芝GaSQS基因核心序列的模板，-20 ℃保存。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.3 鹿角靈芝GaSQS全長基因的克隆

以靈芝(DQ494674.1)SQS基因序列設計引物(表1)SQS-coreF/R，以1.2反轉錄生成的cDNA為模板，克隆鹿角靈芝SQS基因核心序列，反應體系15 μL，即1 μL cDNA，1.5 μL LA緩沖液 (10×)，2.5 μL dNTP Mix，0.5 μL上下游引物(20 μmol/L)，0.2 μL LA聚合酶混合液 (5 U/μL)，滅菌ddH2O 加至15 μL；PCR反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40個循環；72 ℃延伸8 min，回收至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。以GaSQS核心片段設計GaSQS1-F1/F2特異性正向引物，分別與GaSQS1-R2反向引物組合進行2次巢式PCR，獲得鹿角靈芝GaSQS基因3′端；根據GaSQS基因核心片段設計GaSQS2-R1、GaSQS2-R2和GaSQS-R3特異性反向引物，分別與SMARTerTM RACE cDNA Amplication試劑盒中UPM引物組合進行3次巢式PCR，得到GaSQS基因5′端序列，反應條件均同上[14]。

1.4 鹿角靈芝GaSQS全長基因的生物信息學分析

根據GaSQS基因全長序列，采用ORF Finder預測GaSQS基因開放閱讀框，在線分析軟件Prot Param分析理化特性，Prot Scale分析氨基酸序列的疏水性和親水性，SWISS MODEL在線軟件預測蛋白質三級結構，在String(http：//string-db.org/)中預測蛋白互作網絡；GenBank數據庫BlastP程序預測氨基酸保守域及同源性分析，DNAMAN軟件對其同源氨基酸進行多重比對，用ClustalX和MEGA 7.0 軟件構建鹿角靈芝GaSQS基因系統進化樹[15]。

1.5 茉莉酸甲酯對鹿角靈芝GaSQS基因的誘導表達

采用Primer Premier 6軟件設計特異性引物GaSQS-qF/R，以18S-RNA-F/18S-RNA-R為內參引物(表1)，通過qRT-PCR對GaSQS基因進行實時熒光定量分析，檢測不同濃度MeJA誘導下GaSQS基因表達量的差異[16-17]，3次生物學重復取平均值。

2 結果與分析

2.1 鹿角靈芝GaSQS基因cDNA全長克隆

以SQS-coreF/R引物進行RT-PCR擴增，獲得972 bp基因片段(圖2-A)，經BlastP比對表明該片段編碼氨基酸與較多多孔科菌類的鯊烯合酶均具較高的同源性(80%～99%)，可見，分離得到的片段為鹿角靈芝SQS基因的核心序列；基于SQS基因核心序列，進行5′-RACE與3′-RACE PCR擴增，分別得到676，795 bp的明亮條帶(圖2-B-C)，采用SeqMan程序將5′-RACE、核心序列與3′-RACE 3段DNA序列進行拼接，獲得一條長度為1 969 bp的DNA片段。通過ORF Finder 預測SQS基因cDNA為1 515 bp，設計跨ORF引物GaSQS-F/R進行RT-PCR驗證，得到約2 000 bp的片段(圖2-D)，說明該片段包含完整SQS基因的ORF，表明成功獲得鹿角靈芝SQS基因的全長序列，即GaSQS。

2.2 鹿角靈芝GaSQS基因理化特性分析

GaSQS蛋白表達圖譜如圖3，與2.1預測大小一致。鹿角靈芝GaSQS基因全長為1 969 bp(圖4)，包含一個1 515 bp的完整開放閱讀框(ORF)，編碼504個氨基酸，其5′-UTR長204 bp，3′-UTR長250 bp，ProtParam 分析表明，GaSQS蛋白質分子式為C2594H4051N735O742S25，含8 147個原子，分子量為58.2 ku，等電點pI為6.62，含有68個帶負電荷氨基酸殘基，65個帶正電荷氨基酸殘，亮氨酸(Leu)含量最高(10.3%)，半胱氨酸(Leu)含量最高(1.8%)，脂肪系數84.98；ProtScale分析表明，GaSQS蛋白親水性氨基酸數量顯著多于疏水性氨基酸數量，242，243位氨基酸殘基的親水性最強(MIN：-2.544)，81位的疏水性最強(MAX：3.144)，推斷GaSQS蛋白為親水性蛋白；SignalP-4.1預測GaSQS蛋白無信號肽，無剪切位點，說明該蛋白翻譯后無需跨膜轉運；PSORT Prediction預測蛋白質的亞細胞定位表明，該蛋白質可能存在于細胞質中；Smart在線分析，GaSQS蛋白具有1個跨膜結構域(56～343，9.2e-24)；Blast保守結構域預測GaSQS蛋白具有萜類化合物典型的3個保守區：2個酶的底物結合域、底物-Mg2+結合位點與2個富含天冬氨酸域。SOPMA預測GaSQS蛋白二級結構包括α-螺旋(59.52%)、無規則卷曲(28.37%)、延伸鏈(8.53%)和β-轉角(3.57%)；SWISS-MODEL預測三級結構(圖5)表明，GaSQS蛋白具有由多個α-螺旋形成的中央激活位點空穴區域，符合鯊烯合酶的理化特性，有利于形成底物結合域和催化位點，該區域可與Mg2+結合，而Mg2+又能與底物二磷酸結合，因此，推測該核心部位可能是酶的活性中心。

2.3 鹿角靈芝GaSQS蛋白的系統進化分析

經Blast比對，GaSQS蛋白與較多多孔菌科菌類均具有較高同源性(80%～99%)，從NCBI 數據庫選取16個與GaSQS蛋白高度同源的SQS氨基酸序列，用MEGA 7.0構建SQS蛋白系統進化樹(圖6)。結果表明，17個SQS氨基酸序列匯聚為兩大支，其中木蹄層孔菌(Heliocybesulcata(TFK48357.1))單獨聚為一支，為法呢酯焦磷酸合酶(FPS)，另一支均為多孔菌科的鯊烯合酶SQS，鹿角靈芝的GaSQS蛋白與靈芝(Ganodermalucidum(ABF57213.1))的SQS蛋白表現出較高的同源性(99%)，其次是靈芝(AHN91949.1)和紫芝(GanodermasinenseZZ0214-1(PIL24868.1))，三者均屬于靈芝屬，親緣關系最為相近，說明該蛋白高度保守。

2.4 鹿角靈芝GaSQS基因表達分析

2.4.1 不同發育階段GaSQS基因表達水平與含量變化 以GaSQS-qF/R為引物，采用qRT-PCR技術檢測GaSQS基因在鹿角靈芝不同發育階段的相對表達量，即菌絲期、原基期和子實體期。結果表明：GaSQS基因在鹿角靈芝的不同發育階段表達水平呈動態化波動(圖7)，菌絲期1～15 d 該基因的表達量有逐漸上升趨勢，在原基期達到峰值，子實體期略下降，原基期表達量約為子實體期的1.14倍，約為菌絲期5 d 的4.84倍；提取不同發育階段的靈芝三萜，在波長551 nm時測定吸光度，并計算靈芝三帖的含量。結果顯示，靈芝三帖的含量在原基期最高(4.68 mg/g)，約為菌絲期第5天的 3.44倍，與其他發育階段的含量均存在差異，子實體期三萜含量略有下降趨勢，說明鹿角靈芝在原基和子實體初期鯊烯合酶(GaSQS)的表達量與產量均較高。

2.4.2 不同濃度茉莉酸甲酯誘導下GaSQS基因表達水平 以濃度為50～300 μmol/L的MeJA處理鹿角靈芝12 h(圖8)，均能誘導GaSQS基因的高效表達，且相對表達量呈先上升后急劇下降的趨勢，其中MeJA的濃度在200 μmol/L時，GaSQS基因的相對表達量達到峰值，約為空白對照組的9.74倍。結果表明，MeJA能誘導靈芝三萜生物合成途徑中關鍵酶GaSQS基因有效表達，提高靈芝三萜產量，當茉莉酸甲酯的濃度為200 μmol/L時誘導表達效果最佳，當濃度大于200 μmol/L時，可能出現抑制作用而誘導效果減弱。

2.5 鹿角靈芝GaSQS蛋白互作網絡分析

String蛋白互作網絡分析表明，與GaSQS蛋白互作的蛋白質共有10個(圖9)，即：鯊烯環氧酶、甾醇14α-去甲基化酶、異戊烯基焦磷酸異構酶、甲基固GaSqs.鹿角靈芝鯊烯合酶；Sqle.鯊烯環氧酶；Cyp51.甾醇14α-去甲基化酶； ldi1.異戊烯基焦磷酸異構酶； Msmo1.甲基固醇單加氧酶；Ggps1.牦牛兒基焦磷酸合酶； Lss.羊毛甾醇合酶；Mvd.焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶；Sc5d.烯膽固烷醇氧化酶；Fdps.法呢酯焦磷酸合酶；Nsdhl.4α-羧基固醇-3-脫氫酶。

醇單加氧酶、牦牛兒基焦磷酸合酶、羊毛甾醇合酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶、烯膽固烷醇氧化酶法呢酯焦磷酸合酶和4-羧基固醇3-脫氫酶，這些蛋白均是生物合成三萜、甾醇、膽固醇等萜烯類重要酶類，說明GaSQS是靈芝三萜合成途徑中最關鍵的酶，與靈芝三萜含量的多少有著密切的關系。

3 討論

近年來，人們對天然藥物的需求不斷增加，從天然藥物中提取高含量、高藥效的次生代謝產物已備受關注，萜類次生代謝工程很大程度上解決了藥用真菌類天然藥物資源短缺的問題，利用次生物質代謝工程調控合成途徑的代謝流來提高藥效成分的終產量；礙于真菌類生物遺傳背景復雜，基因信息挖掘甚少，致使該類生物的次生代謝研究緩慢。隨著基因工程與分子生物學技術的不斷進步，結合基因組學技術，深入挖掘、分離功能基因，如鹿角靈芝三萜類化合物合成代謝過程中的關鍵酶基因GaSQS，探究其次生代謝過程，提高靈芝三萜含量具有重要價值，并最終達到調控靈芝三萜合成途徑的目的；專家對靈芝三萜具有保肝、抗腫瘤、抗HIV病毒等方面進行了深入的研究，尤其抗腫瘤作用已成為研究的熱點，如有效抑制人類肝癌細胞、乳腺癌細胞等多種腫瘤的生長，Gao等[18]發現靈芝三萜可通過抑制血管內皮細胞生長因子的蛋白表達，達到抑制口腔黏膜癌的效果；唐慶九等[19]發現靈芝三萜可導致腸癌細胞凋亡，并對多種腫瘤具有抑制效果；陳潔等[20]發現三萜類化合物對由CCL4導致的小鼠肝臟纖維化抑制明顯，并對小鼠肝肉瘤細胞增殖抑制作用較明顯，其機制可能是通過降低合成膠原纖維的相關蛋白表達來實現的。本研究通過生物信息學手段挖掘、解析鹿角靈芝功能基因GaSQS的結構與功能，鯊烯合酶(SQS)位于法呢酯焦磷酸(FPP)分支到靈芝三萜合成途徑，FPP除了可以被SQS催化生成鯊烯(SQ)外，在其他酶的催化下亦可以生成類胡蘿卜素、赤霉素等；可見，SQS是三萜、甾醇、膽固醇等萜烯類生物合成途徑中的關鍵酶，所以SQS的含量與活性決定了后續產物靈芝三萜的產量。本研究通過 RT-PCR與RACE技術克隆了調控靈芝三萜合成限速步驟的關鍵酶GaSQS全長基因，以期實現利用次生代謝工程手段提高鹿角靈芝有效成分靈芝三萜的含量，以提高鹿角靈芝的品質，為采用分子育種技術改良和培育鹿角靈芝新品種，促進該品種的可持續、優良發展以及次生代謝工程的發展奠定基礎。

鹿角靈芝作為大型藥用真菌，具有極高的營養價值和保健價值，鹿角靈芝生長的環境條件對靈芝三萜的含量影響顯著，通過增加外源誘導物和環境信號作為環境激發子，提高生物合成途徑中關鍵酶的活性和表達量，最終達到提高靈芝三萜產量的目的。MeJA是通過硬脂酸途徑產生的脂肪衍生物，存在于大多數植物中，當植物受創后會產生受傷信號，并產生茉莉酸類物質(如MeJA)來提高植物的抗性，所以，MeJA被認為是一種信號分子，能誘導許多植物及真菌類產生生理反應，MeJA對生物體的調節作用主要體現在兩方面：一是在轉錄水平影響次生代謝過程，調節防御系統；二是調控生長發育及衰老等過程。目前，國內外專家致力于將MeJA作為誘導物調控生物次生代謝途徑，Lee等[21]研究表明，MeJA可誘導香樹素合成酶和鯊烯環氧酶的過表達，提高人參中人參皂苷的含量；Hayashi等[22]研究表明，MeJA不僅能誘導萜烯類化合物大豆皂甙的生物合成，激活氧化鯊烯環化酶和香樹素合成酶基因的活性，而且MeJA也可誘導萜類和甾醇類生物合成途徑中的關鍵酶SQS。所以，本試驗在鹿角靈芝液體培養條件下，探究添加不同濃度MeJA對靈芝三萜表達量的影響，結果表明，MeJA可以信號分子的形式誘導鹿角靈芝次生代謝物靈芝三萜表達量的增加，調控關鍵酶基因GaSQS的過表達，提高關鍵酶的活性，其中當MeJA的濃度為200 μmol/L時，GaSQS基因的相對表達量達到峰值，約為對照組的9.74倍，達到調控靈芝三萜表達的目的。Song等[23]發現MeJA可誘導靈芝細胞內物質運輸、蛋白質降解等相關基因的過表達，如SNARE蛋白和泛素連接酶等，SNARE是膜泡運輸途徑中的關鍵蛋白，參與真菌產孢和維持細胞壁完整性等過程，推測MeJA可能是通過誘導SNARE蛋白的過表達，進而提高靈芝三萜生物合成途徑中GaSQS的轉運效率，達到提高靈芝三萜產量的目的，有助于揭示調控靈芝三萜生物合成的分子機制，以期采用基因工程手段提高鹿角靈芝藥用成分活性，為其他萜烯類化合物的生物合成調控提供線索與借鑒，此外，深入開展次生代謝產物合成途徑的調控研究，有利于培育鹿角靈芝優良品系，為滿足市場需求化種植和質量調控提供技術支持，更好地推動中藥材品質發展。