水稻OsHSP40基因可變剪接體鑒定及表達分析

喻錦莉，劉長愛，符 霖，王 鑫，歐陽解秀

(南昌大學 生命科學學院，江西省分子生物學與基因工程重點實驗室，江西 南昌 330031)

可變剪接(Alternative splicing，AS)又稱為選擇性剪接，指單個mRNA前體(pre-mRNA)通過不同的剪接方式產生多個成熟的mRNA，是一種典型的轉錄后調控方式[1-2]。在真核生物中，基因的AS過程有助于豐富蛋白質的多樣性；另外，與宿主基因共轉錄內含子miR400降低pri-miR400的加工效率和成熟miR400的表達[3]。基因的可變剪接在植物發育、生理代謝、環境脅迫及植物抗病中發揮重要作用[4-5]。研究發現，內含子促進miR528的產生，同時轉錄本中3′片段縮短可以對miR528產生正向調控，通過影響miR528基因的轉錄或miR528轉錄本的可變剪接，從而影響到水稻開花[3]。高溫影響OsbZIP58的可變剪接，促進了全長OsbZIP58α蛋白形式轉變成截短的OsbZIP58β蛋白形式，來提高灌漿期間水稻耐熱性[6]。OsLG3b區域的6個SNPs導致其選擇性剪接，從而影響水稻籽粒的粒長[7]。

熱激蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是一類進化上非常保守的蛋白，在真核和原核生物中廣泛存在，具有保護機體免受非生物脅迫的危害功能[8-9]。根據分子量、系統發育同源性和功能，HSPs通常被分為5個亞科，分別是小熱激蛋白(sHSPs)、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100s家族[10]。其中，sHSPs是指蛋白分子量為15～42 ku的一類熱激蛋白，研究顯示sHSPs的表達受到高溫、鹽、干旱等多種逆境的影響來發揮生物學功能[11-12]。另外，sHSPs還可以作為在擬南芥中，過量表達AtHSP17.6A提升了擬南芥對鹽和干旱的耐受性[12]。過表達JrsHSP17.3提高轉基因核桃植株對鹽和耐熱耐寒的性能[13]。

水稻作為世界重要的糧食作物，其產量受到高溫、鹽、干旱等非生物脅迫的影響[9，14]。在水稻中鑒定到23個sHSPs，通過RT-PCR分析發現大部分sHSPs的表達受到高溫脅迫的影響[15]。Sato等[16]研究發現，在水稻中過量表達OsHSP17.7，有效提高植株對UV-B、干旱和熱脅迫的耐受性。OsHsp18.0過表達株系對細菌性條斑病的抗性增強，而抑制株系的抗性下降[17]。在大腸桿菌和畢赤酵母細胞中的異源表達OsHSP20增強了其對熱鹽脅迫的耐受性。組成性過表達OsHSP20的轉基因水稻植株在熱、鹽處理條件下根長和發芽率高于對照植株[18]。目前，關于水稻中sHSPs的生物學功能報道較少。

在Phytozome數據庫(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中發現sHSPs的另一個成員OsHSP40，通過生物信息學分析發現，該基因具有不同的可變剪接。前期研究發現該基因的表達受到鹽脅迫的影響[9]，但是該基因生物學功能鮮有報道，有待于進一步研究。本研究根據生物信息學分析結果設計特異性引物，以中花11為材料，利用RT-PCR和TA克隆技術對OsHSP40基因的不同剪接本進行鑒定，以確定其存在的可變剪接體，為后續深入研究該基因在水稻生長發育和逆境適應過程中的生物學功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗用的植株材料為粳稻中花11(ZH11)由江西省分子生物學與基因工程重點實驗室提供。超薄DNA產物純化試劑盒和DNA割膠回收試劑盒(TIANGEN)、金牌Mix(TSINGKE)、TransTaq HiFi DNA聚合酶(TRAN)。

1.2 試驗菌株及載體

大腸埃希菌DH5α(上海唯地生物技術有限公司)、PMD18-T(TaKaRa)。

1.3 引物設計

在Phytozome網站(https：//phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html)分別下載水稻OsHSP40可能存在的不同剪接體的參考序列，并編號為1～4號可變剪接體(表1)，根據這些可變剪接體的序列特征，設計特異的RT-PCR引物(表2)。

表1 水稻OsHSP40基因可能存在的4種可變剪接體Tab.1 Four putative splice variants of rice OsHSP40

1.4 樣品逆境處理

參考文獻[19-20]報道的試驗方法：選取生長21 d的ZH11幼苗進行150 mmol/L鹽處理，處理后3，6，9 h進行取樣，并迅速凍于液氮中后-80 ℃保存。選取生長21 d的ZH11幼苗進行42 ℃高溫處理，處理后2，4，6，8，12，24 h進行取樣，并迅速凍于液氮中后-80 ℃保存。不同水稻組織樣品經液氮研磨成粉末，采用TRIzol法提取水稻不同組織的總RNA。按照TIANGEN 的反轉錄試劑盒(TIANGEN)說明書合成cDNA第一鏈[9]。

1.5 RT-PCR

以葉片或者其他組織的cDNA為模板，利用DNA聚合酶和表2中的特異性引物對OsHSP40基因的不同剪接本進行擴增。經DNA割膠回收或者超薄回收獲得目的產物后，進行TA克隆[21]。

1.6 TA克隆

根據試劑盒說明將純化得到的目的片段與pMD8-T載體進行連接，采用10 μL體系16 ℃連接30 min。連接體系包含5 μL目的片段、0.5 μL載體和4.5 μL Solution I。轉化大腸桿菌，進行抗性篩選，獲得陽性克隆進行測序驗證。

表2 引物信息Tab.2 Information of primers

2 結果與分析

2.1 OsHSP40基因可變剪接體及其RT-PCR特異引物位置

根據Phytozome(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)網站數據，OsHSP40預測存在4種不同的剪接體，分別命名為OsHsp40.1、OsHsp40.2、OsHsp40.3和OsHsp40.4，不同可變剪接體如圖1-A所示。預測顯示，OsHSP40基因可變剪接體的CDS序列長度分別是1 230，1 227，1 155，1 125 bp(表1)，1號可變剪接體比2號可變剪接體在第1個外顯子中多3個堿基(AGC)。3號可變剪接體是由于引物e所在位置成為外顯子，4號可變剪接體則是由于引物d所在位置轉變成為外顯子。根據OsHSP40基因不同可變剪接體的序列及結構特征設計RT-PCR擴增的特異性引物(圖1-A、表2)。

2.2 OsHSP40基因可變剪接體擴增及克隆

利用野生型ZH11的cDNA為模板，采用特異性引物組合進行RT-PCR擴增，首先，采用引物b/e組合進行PCR擴增，電泳檢測后具有清晰約100 bp大小的電泳條帶，說明3號剪接體可能存在(圖1-B)；引物b/d組合擴增后具有約150 bp的電泳條帶(圖1-C)，說明剪接體4可能存在，將擴增獲得的目的產物測序，進一步驗證了可變剪接體3和4的存在；最后利用引物a/c組合PCR擴增后具有清晰的電泳條帶(圖1-D)，說明OsHSP40基因的1、2和4號可變剪接體可能存在，由于OsHSP40可變剪接體1和2相差3個堿基(AGC)，故對引物a/c組合的擴增產物進行TA克隆，對陽性菌落進行測序驗證，對測序結果分析發現，測序獲得樣品中有12個單菌落克隆為1號可變剪接體，只有1個為2號可變剪接體，這一結果表明，OsHSP40基因的1號可變剪接體的表達量可能遠高于2號可變剪接體。綜上，成功鑒定到OsHSP40的4種可變剪接體。

2.3 OsHSP40可變剪接體表達分析

為了研究OsHSP40的生物學功能，選取野生型水稻ZH11不同組織部位，包括根、莖和葉，利用RT-PCR對OsHSP40不同可變剪接體的表達模式進行分析。發現，OsHSP40(OsHsp40.1234)基因在ZH11根、莖和葉中均表達，呈組成型表達；OsHSP40可變剪接體4(OsHsp40.4)在所檢測的ZH11根、莖和葉中表達，在葉片中的表達量高于其在根和莖中的表達量(圖2)。這一結果表明，OsHSP40不同的可變剪接體表達模式可能存在差異。

2.4 高鹽條件下OsHSP40可變剪接體表達分析

前期研究發現，該基因的表達受到鹽脅迫的影響[9]，不同OsHSP40可變剪接體在高鹽脅迫過程中響應是否存在差異，采用3周齡的ZH11幼苗進行150 mmol/L鹽溶液處理，處理后3，6，9 h分別取地上和地下部分的組織進行表達分析，結果發現(圖3)，在未處理時可變剪接體4(OsHsp40.4)在地上和地下部分中的表達量均顯著低于OsHSP40的表達，該結果進一步證實OsHSP40基因存在可變剪接體4(OsHsp40.4)；高鹽處理后，在地上部分的組織中，可變剪接體4(OsHsp40.4)的表達量上升，處理9 h后最高，但上升幅度低于OsHsp40.1234。在地下部分的組織中，處理6 h后OsHsp40.1234的表達顯著升高達到峰值，9 h后下降；可變剪接體OsHsp40.4的表達則在處理3 h開始上升，處理9 h后高于其他時期。這一表達結果顯示，OsHSP40基因及其可變剪接體的表達受到高鹽脅迫的誘導，高鹽條件下OsHsp40.4與OsHsp40.1234的表達方式存在一定的差異。

2.5 高溫條件下OsHSP40可變剪接體表達分析

熱激蛋白(HSPs)是指當細胞或生物體遭受高于其正常生長所需溫度8～12 ℃時，在幾小時、甚至幾分鐘內會新合成一類蛋白質。不同OsHSP40可變剪接體在高溫脅迫過程中響應是否存在差異，采用3周齡的ZH11幼苗進行42 ℃處理，處理后2，4，8，12 h分別取地上和地下部的組織進行表達分析結果發現，在水稻幼苗地上組織中，OsHsp40.1234基因在處理后2 h表達變化不顯著，處理后4 h，其表達顯著上升，處理后的4～12 h表達量都顯著升高；而剪接體OsHsp40.4的表達則處理2 h后開始上升，一直到處理后12 h達到最高。在地下組織中OsHsp40.4和OsHsp40.1234的表達在處理后2 h顯著上升，處理后8 h達到最高，處理后12 h表達上升幅度降低(圖4)。

3 結論與討論

基因的可變剪接在真核生物中廣泛存在，在植物發育、生理代謝、環境脅迫及植物抗病反應中發揮重要作用[4-5]。水稻FLO10功能缺失會影響線粒體nad1基因內含子1的反式剪接，導致nad1外顯子1和外顯子2-5前體的積累，FLO10在維持線粒體功能和胚乳發育中起重要作用[22]。OsLG3b基因8外顯子上的堿基替換引起一個可變剪接，導致轉錄提前終止，進而產生了一個C端截短了的蛋白質，調控籽粒長度增長[7]。利用RT-PCR與TA克隆實驗，成功的分離鑒定到OsHSP40基因的4種不同可變剪接體，在進行TA克隆測序過程中，發現1號可變剪接體轉錄水平可能高于2號可變剪接體。

植物熱激蛋白是高度保守的蛋白質分子家族，起到分子伴侶、熱防御和穩定細胞結構等功能。根據其表達的條件及作用可分為兩類：在脅迫條件下表達的應激熱激蛋白；在生物體整體條件下存在表達，應激時表達量增加的組成型熱激蛋白[23]。本研究發現，OsHSP40在檢測的根、莖、葉中均表達，說明該基因可能屬于組成型熱激蛋白。非生物脅迫下，植物的HSP基因具有時空調控作用，其表達受到各種非生物脅迫的影響[24]。試驗顯示，OsHSP40在鹽脅迫和高溫脅迫條件下，表達量上升，說明該基因的表達受到鹽和高溫脅迫的誘導表達。根據分子量、系統發育同源性和功能，HSPs通常被分為5個亞科，分別是小熱激蛋白(sHSPs)、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100s家族[10]。分析預測顯示，OsHSP40蛋白大小約40 ku，說明其屬于sHSPs家族成員。

基因的可變剪接在植物發育及適應脅迫反應中發揮重要作用，基因選擇性剪接在維持水稻礦質營養穩態中起著重要作用[25]。基因可變剪接有助于水稻保持系HuHan2B抗旱性的遺傳改良[26]。水稻不同OsGATA轉錄因子在非生物脅迫信號傳導過程中發揮重要作用，同時OsGATA基因剪接變異在不同環境條件下緊密調控[27]。OsGBF1存在多種可變剪接變體，這些剪接體在水稻中可能具有特異性的抗逆性功能[28]。在水稻幼苗地上組織中，OsHSP40基因在高溫處理后2 h表達變化不顯著，處理后4 h，其表達顯著上升；而剪接體OsHsp40.4的表達則處理2 h后開始上升，一直到處理后 12 h達到最高。高鹽條件下OsHsp40.4與OsHsp40.1234的表達方式存在一定的差異。說明OsHSP40基因的可變剪接體可能在高鹽和高溫脅迫過程中的發揮存在一定的差異。