牡丹PsZFP1轉錄因子的特性及表達分析

劉 慶，孫廷釗，蓋樹鵬，張玉喜，劉春英

(青島農業大學 生命科學學院，山東省高校植物生物技術重點實驗室，山東 青島 266109)

鋅指蛋白(Zinc finger protein，ZFP)是植物中最大的轉錄因子家族之一，在植物生長發育和逆境響應中均起著重要作用。ZFP最早是在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的卵母細胞中發現的[1]。鋅指蛋白均具有保守的鋅指結構域，根據其序列結構和功能的不同，將其分為C8、C6、C4、C2H2、C3H、C3HC4、C2HC、C2HC5和C4HC39種類型[2]。近些年研究發現，擬南芥中的CCCH型鋅指蛋白HUA1參與了開花過程的調控[3]；麻瘋樹鋅指蛋白JcZFP8在煙草中異源表達，發現其可能通過激素信號轉導途徑間接調控煙草的毛狀體發育[4]；蓖麻鋅指蛋白RcDof參與調控其植株矮化[5]；沙冬青C2H2型鋅指蛋白基因AmZFP1的轉錄水平在干旱或者低溫脅迫下均明顯升高，推測其可能在沙冬青的抗旱和抗寒過程中起重要調節作用[6]。此外，Huang等[7]發現過表達OsZFP245基因的水稻株系中脯氨酸含量升高，活性氧清除能力增強，其耐受低溫和干旱脅迫的能力顯著提高。可見，鋅指蛋白在植物冷響應中發揮了重要作用。

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是原產中國的名貴木本花卉[8]，觀賞價值和經濟價值極高。反季節催花是牡丹產業的重要組成部分，其關鍵問題是解除花芽內休眠[9]。越來越多的證據表明，低溫是打破花芽內休眠的有效途徑[10]。前期利用抑制消減文庫篩選到可能與內休眠解除相關的線粒體磷酸轉移子(Mitochondrial phosphate transporter，PsMPT)，該基因受低溫累積誘導，調控能量代謝，促進休眠解除[11-12]；并證明其啟動子中的MYC為響應低溫的順式作用元件[13]。最近，通過酵母單雜交篩選到一個可能與MYC序列相互作用的鋅指蛋白PsZFP1。本研究克隆了PsZFP1的開放閱讀框(ORF)并對其進行了生物信息學、表達特性和轉錄因子特性分析，構建原核表達載體并轉化BL21，最后將表達出的可溶性重組蛋白純化，旨在為進一步研究PsZFP1參與調控牡丹花芽休眠解除機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗材料 4～5年生牡丹品種魯菏紅(PaeoniasuffruticosaLuhehong)的健壯植株(購自山東菏澤牡丹研究所)。

1.1.2 質粒及菌種 質粒pGBKT7和酵母菌株Y187購自CLONTECH公司；克隆載體質粒pMD18-T購自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α、農桿菌GV3101和質粒pBI121由青島農業大學植物遺傳與發育實驗室保存；大腸桿菌BL21和原核表達載體pET28a+由郭寶太教授饋贈。

1.1.3 主要試劑 各種限制性內切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker、Protein Marker、SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)、PrimeScript?RT Master Mix (Perfect Real Time)和SYBR?PremixExTaqTM(Tli RNase H Plus)均購自大連的TaKaRa公司；RNAprep pure Plant Kit和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；SanPrep柱式質粒小量抽提試劑盒和Ni-NTA重力預裝柱購自上海生工生物工程有限公司；化學試劑均為國產分析純。

1.1.4 材料處理及取樣 將4～5 年生牡丹魯菏紅的健壯植株分別在4 ℃冷庫中處理0，7，14，21，28 d后，選取健壯頂端花芽，剝去外層鱗片，液氮速凍，-80 ℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取和檢測 采用RNAprep pure Plant Kit(DP441)提取花芽的總RNA，然后利用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳和微量ND 1000分光光度計(Thermo)分別對提取的總RNA進行質量和濃度檢測。

1.2.2PsZFP1的全長cDNA擴增及生物信息學分析 設計特異引物PsZFP1-5′(表1)與SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit中的自帶引物UPM配對使用。以牡丹花芽的總RNA為模板，按照試劑盒說明書進行5′-RACE擴增。將回收的5′-RACE擴增片段連接轉化和測序拼接后，得到PsZFP1基因的全長cDNA序列。用EditSeq軟件分析PsZFP1序列的開放閱讀框序列，用MEGA 6.0軟件進行該蛋白的系統進化樹分析。

1.2.3PsZFP1基因ORF的克隆 根據PsZFP1的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)設計帶有不同酶切位點的引物(表1)，以cDNA為模板，采用EasyTaq?DNA Polymerase(全式金，北京)擴增目的基因。經連接轉化、菌落PCR和質粒雙酶切鑒定得到陽性克隆，將其送至擎科生物公司測序。獲得的PsZFP1基因的ORF用于構建不同載體，進行PsZFP1的亞細胞定位、轉錄激活分析和原核表達。

1.2.4 PsZFP1的亞細胞定位 將1.2.3中擴增得到的PsZFP1的ORF(不含終止密碼子)構建到pBI121-GFP載體上，獲得pBI121-PsZFP1-GFP表達載體。將pBI121-GFP(對照)和pBI121-PsZFP1-GFP分別轉化農桿菌，侵染煙草(Nicotianabenthamiana)葉片，暗培養24 h，光照培養72 h后使用激光共聚焦顯微鏡觀察，利用熒光染料DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole)指示細胞核位置。

表1 本研究中所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.5 PsZFP1的轉錄激活分析 將PsZFP1ORF重組到pGBKT7載體上，pGBKT7(對照)和pGBKT7-PsZFP1分別轉化酵母菌株Y187，并在SD/-Trp、SD/-Trp/-His/-Ade和含有X-α-gal的SD/-Trp/-His/-Ade培養基上培養3～5 d，觀察并拍照。

1.2.6PsMPT啟動子與PsZFP1蛋白互作檢測 將PsMPT基因啟動子序列中的低溫響應元件MYC的三重復序列重組到pHIS2.1載體上，獲得pHIS2.1-MYC重組誘餌表達質粒。將PsZFP1的ORF重組到pGADT7載體上，獲得pGADT7-PsZFP1重組質粒。將pHIS2.1-MYC分別與 pGADT7(對照)和pGADT7-PsZFP1共同轉化酵母菌株Y187，在SD-Leu/-Trp培養4 d后，挑取單菌落分別溶于200 μL滅菌超純水中，并分別吸取原液、稀釋10，100倍的稀釋液各2 μL，按濃度依次點在SD/-His/-Leu/-Trp/50 mmol/L 3-AT培養基上培養3～5 d，觀察并拍照。

1.2.7PsZFP1的表達特性分析 分別以4 ℃處理 0，7，14，21，28 d的牡丹花芽cDNA為模板，采用qRT-PCR技術檢測PsZFP1基因在低溫解除休眠過程中的轉錄水平，所用引物見表1，qRT-PCR體系按照SYBR Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa)配制，在Applied Biosystems Quant Studio TM 5(ABI，美國)熒光定量PCR系統上運行。以牡丹的Actin基因為內參，用2-ΔΔCt法進行數據分析。3個生物學重復。

1.2.8PsZFP1的原核表達及純化 將PsZFP1ORF插入到原核表達載體pET28a+，經PCR和酶切鑒定后，將重組質粒pET28a+-PsZFP1轉化至菌株BL21。選取陽性克隆至含Kan的 LB液體培養基中培養。提取水溶性蛋白和包涵體，進行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍染色后，再用脫色液脫色至蛋白條帶清晰可見。重組蛋白使用Ni-NTA親和層析技術分離純化，并利用SDS-PAGE檢測。

2 結果與分析

2.1 PsZFP1基因的5′-RACE擴增及生物信息學分析

以牡丹花芽的總RNA為模板，反轉錄合成cDNA，然后對PsZFP1基因進行5′-RACE擴增，結果如圖1所示。測序結果顯示，擴增得到的5′-RACE序列為987 bp，與本實驗室前期獲得的PsZFP1基因的序列進行拼接后，獲得PsZFP1基因的全長cDNA序列為1 313 bp，包含5′-UTR序列204 bp，3′-UTR序列194 bp，最大ORF為915 bp，編碼304個氨基酸。推測該蛋白的理論分子量約為31.829 ku，等電點(pI)為9.41，推測其分子式為C1379H2159N417O415S19，不穩定系數36.8，為親水性的穩定蛋白，具有CCCH保守結構域(圖2)。用MEGA 6.0軟件構建牡丹PsZFP1與其他12個物種ZFP的系統進化樹，發現牡丹PsZFP1與葡萄VvZFP的親緣關系最近(圖3)。

2.2 PsZFP1基因的ORF擴增

以牡丹花芽的cDNA為模板，PCR擴增含有不同酶切位點的PsZFP1的ORF序列，得到與預期大小一致的特異條帶(圖4)，用于構建不同載體進行后續試驗。

2.3 PsZFP1的亞細胞定位

利用熒光顯微鏡觀察PsZFP1的亞細胞定位，發現其定位于細胞核中(圖5)。

2.4 PsZFP1的轉錄激活分析

如圖6所示，含有pGBKT7的酵母菌株Y187(對照菌)可以在SD/-Trp培養基上生長，但在SD/-Trp/-His/-Ade和含有X-α-gal的SD/-Trp/-His/-Ade培養基上均無法生長。而含有pGBKT7-PsZFP1的酵母菌株Y187(重組菌)在3種培養基上均可生長，且在含有X-α-gal的SD/-Trp/-His/-Ade培養基上生長的菌落顯藍色，這表明PsZFP1具有轉錄激活活性。

2.5 PsMPT啟動子與PsZFP1蛋白互作檢測

如圖7所示，只有含pGADT7-PsZFP1+pHIS2.1-MYC的酵母菌株Y187可以在TDO(SD/-His/-Leu/-Trp/+50 mmol/L 3-AT)培養基上生長，而含pGADT7+pHIS2.1-MYC的酵母菌株Y187(對照菌)不能在TDO培養基上生長，表明PsZFP1可以與PsMPT啟動子的MYC元件互作。

2.6 PsZFP1的表達特性分析

為研究PsZFP1基因的表達是否受低溫累積誘導，本研究利用qRT-PCR技術分析了PsZFP1基因在低溫處理不同時間的花芽中的表達模式。結果表明，PsZFP1基因的表達量隨低溫天數的增加呈上調趨勢，在低溫21 d時其表達水平達到峰值，但在低溫28 d時表達量顯著下降(圖8)。

2.7 PsZFP1的原核表達及純化

經IPTG誘導后，含重組質粒pET28a+-PsZFP1的原核表達菌株BL21表達出分子量約為37 ku的重組蛋白，且重組蛋白主要集中在包涵體中(圖9-A)。利用Ni-NTA親和層析技術純化重組蛋白，SDS-PAGE檢測結果顯示成功獲得較為純凈的重組蛋白(圖9-B)。

3 結論與討論

CCCH型鋅指蛋白含有由3個半胱氨酸殘基和1個組氨酸殘基組成的CCCH鋅指結構，通過與RNA、DNA或蛋白質結合直接或間接調控相關靶基因、蛋白質的表達[14-15]。研究表明，甘薯的CCCH型鋅指蛋白IbC3H18是1種核轉錄激活劑，可調控活性氧清除、ABA信號傳導、光合作用和離子傳遞等相關途徑的一些非生物脅迫響應基因的表達[16]。擬南芥AtC3H14蛋白也具有轉錄激活作用，可與靶基因如多聚半乳糖醛酸酶基因的RNA結合，并且參與其靶基因的轉錄后調控[17]。從橡膠樹中分離的蛋白HbCZF1，具有CCCH型鋅指結構，可與HMG1基因的啟動子結合激活3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的表達，調控天然橡膠的生物合成[18]。Zhang等[19]發現水稻的CCCH鋅指蛋白ⅡP4可以抑制次生壁的合成。水稻OsDOS過表達株系的葉片衰老顯著延遲，而Osdos突變株的葉片衰老進程明顯加快[20]。棉花蛋白GhZFP1具有CCCH型結構，過表達GhZFP1的煙草植株的抗立枯絲核菌能力和耐鹽能力均增強[21]。擬南芥的AtC3H7過表達植株的抗鹽脅迫能力更強[22]。近期研究發現，多種PvC3Hs對柳枝稷的抗寒性起調控作用，過表達PvC3H72的柳枝稷株系在4 ℃下的耐寒性明顯增強。PvC3H72與ICE1-CBF-COR調節因子和ABA應答基因共同提高了柳枝稷的抗寒性[23]。在水稻中，低溫脅迫可誘導CCCH型鋅指蛋白OsTZF5基因的表達[24]?？梢姡珻CCH型鋅指蛋白功能是多樣化的。

本研究對牡丹PsZFP1和不同物種中ZFP蛋白的系統進化樹分析結果顯示,PsZFP1與葡萄的VvZFP同源性較高。PsZFP1蛋白的理化性質預測結果表明，該蛋白為親水性的穩定蛋白，具有CCCH保守結構域。PsZFP1蛋白亞細胞定位和轉錄激活活性的試驗證實，PsZFP1蛋白定位于細胞核，且具有轉錄激活活性，因而具備轉錄因子的特性。這與Huang等[7]證實水稻鋅指蛋白OsZFP245定位于細胞核，具有反式激活活性的研究結果相似。

本研究的實時定量分析結果顯示，在低溫0～21 d，PsZFP1表達水平緩慢上調，在低溫21 d時急劇升高，表明該基因受低溫累積所誘導。PsZFP1與前期篩選到的線粒體磷酸轉移子基因的表達規律一致[11]。休眠解除時需要大量能量滿足花芽生理狀態和生長狀態的轉換，作為能量(ATP)合成的關鍵基因，PsMPT表達量此時急劇上升[11-12]，與這一需求相吻合。酵母單雜發現PsZFP1可結合在PsMPT啟動子上，表明PsZFP1可能是在轉錄水平上調控PsMPT表達的重要因子。因此推測：伴隨著低溫的累積，PsZFP1表達水平不斷升高，促進了PsZFP1蛋白積累，進而激活了PsMPT的轉錄和表達，最終促進了牡丹花芽的能量代謝和休眠解除[11-13]。因此，PsZFP1參與了牡丹花芽內休眠的調控，本研究發現了CCCH鋅指蛋白新的功能。進一步構建了原核表達載體pET28a+-PsZFP1，并在適宜條件下進行了誘導表達及純化，獲得了較為純凈的PsZFP1蛋白，為后期研究PsZFP1蛋白的功能，及其參與低溫響應的調控機制，解析牡丹花芽休眠解除的分子機理提供理論基礎。