利用染色體片段置換系定位低溫脅迫下水稻根數QTL

張翔宇，余鎂霞，譚景艾，王 鵬，李才敬，吳光亮，程 琴，王燕寧，蔣寧飛，黃詩穎，賀浩華，2，3，邊建民，2，3

(1.作物生理生態與遺傳育種教育部重點實驗室，江西 南昌 330045；2.作物生理生態與遺傳育種江西省重點實驗室，江西 南昌 330045； 3.江西省水稻高水平工程研究中心，江西 南昌 330045)

水稻是世界上最重要的喜溫糧食作物之一，低溫冷害是水稻整個生長發育過程中經常遭遇的一種自然災害，是限制其生長發育、地理分布以及產量品質形成的主要環境因子之一。水稻因低溫冷害而造成的減產已經是世界范圍內普遍存在的問題，據統計中國每年因低溫損失稻谷約3×109～5×109kg。水稻芽期冷害影響水稻成活率、根和芽生長，導致幼苗活力降低[1]。其中根系是評判水稻能否繼續生長的重要因素之一[2]，因為根系活力是水稻生長情況的一個重要指標，根系活力越高，水稻地下部分對礦物質元素的吸收能力越強，地上部分生長也越好[3]。水稻苗期冷害會影響根系發育，導致根系降低礦物質吸收不足，影響水稻苗期的活力，進而導致水稻產量減少。多數研究結果表明，水稻苗期根數耐冷受數量性狀(QTL)控制[4]，因此，尋找水稻苗期根數耐冷QTL對于解析水稻耐冷分子遺傳基礎，選育耐冷新品種有重要的意義。

隨著分子標記技術的發展，定位了多個低溫脅迫下影響水稻幼苗發育的QTL。比如，以水稻芽期發芽率為耐冷鑒定標準，王棋等[5]以秈稻品種瀘恢 99和粳稻品種沈農265雜交所產生的144個家系為材料共檢測到了3個發芽期耐冷性QTLs分別位于第 3，5，9染色體上命名為qLTG-3、qLTG-5、qSCT-9；紀素蘭等[6]以Kinmaze/DV85重組自交系 (RILs) 群體為材料檢測到11個QTL，其中qLTG-7和qLTG-11可在 3個環境中穩定表達。林靜等[7]利用以秈稻9311為受體、粳稻日本晴為供體的染色體片段置換系(CSSLs)，在5，7號染色體上鑒定出4個芽期耐冷QTL。

死苗率作為水稻耐冷評判標準，嚴長杰等[8]以秈稻品種南京11和粳稻品種巴利為親本構建了67個家系，并在第7號染色體G379b～RG4區間發現存在耐冷有關的基因Cts7。Liu等[9]以存活率為指標，檢測到了分布在6條染色體上的6個QTLs。陳亮等[10]以發芽力作為水稻芽期耐冷評判標準，以珍汕97B與多年生稻 AAV002863為親本的198個家系，構建了140個SSR標記的連鎖圖譜，并檢測到2個低溫發芽力相關的基因座；姜樹坤等[11]以芽期冷處理后恢復狀態為鑒定水稻耐冷評判標準，并把秧苗的恢復狀況分為5個等級；在水稻的1，3，9，11號染色體中檢測到5個芽期耐冷的QTL。韓龍植等[12]以秈粳交密陽23/吉冷1號的F2∶3200個家系作為作圖群體，以水稻根長、根質量為指標在自然條件和12 ℃冷水脅迫下，檢測到在第1，2，6，11，12染色體上17個與根系性狀相關的QTL，對表型變異的解釋率為5.8%～15.2%，其中與最大根的根徑相關，位于第2染色體RM263～RM6區間的qCRD2和位于第11染色體RM21～RM206區間的qCRD11，以及與根干質量相關，位于第2染色體RM262～RM263區間的qCRWT2和位于第11染色體RM229～RM21區間的qCRWT11貢獻率較大，分別為15.0%，15.2%，10.6%和12.2%。

雖然對水稻苗期耐冷性進行了較多的QTL定位，這些QTLs在水稻的12條染色體均有分布[13]，但是檢測到的水稻芽期耐冷QTL大多與發芽率或根長、根質量相關，與芽期根數相關的QTL很少。另外，不同遺傳群體得出的結果也不盡相同，因此，有必要利用更多的遺傳群體對水稻芽期耐冷QTL進行分析，發掘更多的根數耐冷QTL，為水稻冷脅迫根數分子育種提供參考。基于此，本試驗以新構建的9311(受體)/日本晴(供體)染色體片段置換系群體為材料，對低溫冷脅迫下控制水稻芽期根數QTL進行定位分析，以期為克隆水稻低溫脅迫下控制根數發育的基因奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

該試驗材料是以秈稻9311作為輪回親本，粳稻日本晴作為供體親本構建獲得的包含121個株系群體。于2019年7月采集水稻葉片組織樣本，DNA提取、文庫構建和全基因組測序由華大基因科技有限公司協助完成并得出高質量bin標記。

1.2 發芽期耐冷性鑒定

苗期水稻耐冷鑒定采取的是李太貴[14]的方法并微做改動。從親本9311和日本晴以及CSSLs群體中選取30粒籽粒飽滿的種子先經過5.5%的次氯酸鈉消毒后，用蒸餾水漂洗干凈。準備無菌培養皿，并將種子放置于鋪有濾紙的培養皿中，在培養皿中加入蒸餾水至剛好浸沒種子，待種子在常溫25 ℃環境下萌發后，置于恒溫培養箱15 ℃低溫條件下處理7 d，最后在25 ℃恢復生長7 d，測量根數。根數測定標準：每個家系選擇其中整齊一致的10個種子測定其根數。重復3次，計算其平均值用于后期計算分析。

1.3 數據分析

IciMapping V4.2軟件對CSSLs群體進行bin標記分析和QTLs定位。以LOD=2.5為檢測閾值，當QTL的LOD值大于2.5時，認為存在QTL。QTL命名見參考文獻[15]。用SPSS 22軟件與Microsoft Excel 2017內置公式進行顯著性分析。候選基因分析通過查閱http：//rice.plantbiology.msu.edu/網站輸入QTLs所在的物理位置找到基因名稱并在http：//www.ricedata.cn/gene/分析其功能。

2 結果與分析

2.1 根數分析

低溫脅迫后，對9311和日本晴根數進行了調查，發現日本晴平均根數為4.50，9311平均根數為7.20，二者在P=0.01的水平上達到極顯著差異。CSSLs群體根數平均值為4.84，最高值為7.20，最低值為3.13，CSSLs群體根數表現為連續正態分布，其中水稻根數在3～4的為8個；4～5的為69個；5～6的為35個；6～7的為4個；7～8的為2個，存在明顯的超親分離現象，符合QTL定位要求(表1、圖1，2)。

表1 冷脅迫下親本及CSSLs群體根數Tab.1 The root number of the two parents and CSSLs population under cold stress

2.2 QTL定位

采用IciMapping V4.2軟件對低溫脅迫下影響水稻根數的QTL進行分析。在15 ℃低溫脅迫環境下共檢測到2個與水稻根數相關的QTLs(表2)，分別命名為qCSRN1.1和qCSRN3。這2個QTLs分別位于水稻第1號染色體chr1～bin43標記(31.75～33.15 Mb區間)和第3號染色體上chr3～bin179標記處(32.2～32.7 Mb區間)，加性效應值分別為0.78和-0.67，可解釋表型變異的16.26%，9.06%。其中qCSRN1.1增效等位基因來自供體親本日本晴，qCSRN3增效等位基因來自受體親本9311。

2.3 上位性QTL分析

本研究共檢測出2對低溫脅迫下影響水稻根數的上位性互作QTLs(表3)。QTLqCSRN1.1(第1號染色體chr1～bin43標記處)與QTLqCSRN1.2(第1號染色體chr1～bin52標記處)存在互作，LOD值為5.60，互作效應為-0.34；QTLqCSRN1.1(第1號染色體chr1～bin43標記處)與QTLqCSRN9(第9號染色體chr9～bin449標記處)存在互作，LOD值為5.75，互作效應為-0.43。

2.4 候選基因分析

對qCSRN1.1和qCSRN3候選基因分析發現，qCSRN1.1區間內包含138個基因，68個與蛋白合成相關的基因，42個與酶合成相關的基因，3個轉錄因子(圖3)；其中LOC_Os01g56200[16]、LOC_Os01g56470[17]、LOC_Os01g57340[18]已被克隆，這3個基因與稻瘟病、白葉枯病相關。qCSRN3區間內包含88個基因，62個與蛋白合成相關的基因，9個與酶合成相關的基因，3個轉錄因子(圖3)，LOC_Os03g56950[19]、LOC_Os03g57190[20]、LOC_Os03g57220[21]、LOC_Os03g57240[22]已被克隆；LOC_Os03g57190與冷脅迫相關，是OsPCF6的候選基因，其負向調節水稻耐冷性，可能為qCSRN3的候選目標基因。

表2 檢測到的耐冷性QTL位點Tab.2 QTL for clod resistant detected at germination stage and seedling stage

表3 水稻芽期耐冷性的上位性效應位點Tab.3 Epistasis effect of locus for cold tolerance at germination stage in rice

3 討論

水稻根系既是吸收養分和水分的重要器官又是多種激素、有機酸和氨基酸合成的重要場所，其形態和生理特征與地上部的生長發育、產量和品質形成均有著密切的聯系[22]。2011年袁隆平院士將“根系發達”作為水稻新株型的主要性狀之一，根系是否發達與水稻品種的好壞直接相關。根數是水稻根系的一個重要組成因素，有研究表明，水稻根數多少會影響水稻的產量與品質[23]。因此，對水稻根系的研究是非常必要的。而溫度的變化對水稻根數影響較大。為研究低溫脅迫下水稻芽期根數遺傳表現，本研究利用9311/日本晴衍生的CSSLs群體對低溫(15 ℃)條件下控制根數進行了遺傳分析。結果顯示低溫脅迫下，水稻苗期根數生長除受QTL控制的同時還受到上位性QTL互作的影響，表明水稻上位性互作位點對于可能調控苗期根數冷脅迫起到了重要作用。

根數作為評判水稻苗期耐冷性的一個重要指標研究相對較少。前人在水稻根系研究中由于選用品種不同，處理方法不同，因此，檢測到的水稻根數QTL位置、數目、貢獻率都存在著較大差異。本研究利用9311(受體)和日本晴(供體)的染色體置換系群體，在15 ℃條件下檢測出2個根數QTLs(qCSRN1.1和qCSRN3)。通過與前人根數QTL比較發現，qCSRN1.1與前人定位耐冷相關QTL(基因)位置不同，表明qCSRN1.1可能是一個新的耐冷QTL。qCSRN3與 Andaya等[24]定位的QTLqPSST-3(Chr3，32.0～35.1 MB)位置重疊，qPSST-3是控制水稻芽期耐冷的QTL，表明qCSRN3可能為一個冷脅迫控制水稻的主效位點。

水稻苗期耐冷性狀屬于數量性狀，易受環境影響，不同環境、不同栽培條件、不同群體定位到的QTL不同[25]，使用遺傳背景復雜的重組自交系群體為后續克隆和解析這些耐冷基因增加了難度。本研究采用染色體置換系進行了苗期耐冷試驗，該群體只存在群體之間片段代換的差異，并且該群體遺傳背景簡單，QTL定位消除了其他背景的干擾，可以通過進一步雜交形成F2次級分離群體把QTL定位到更小的區間，從而實現基因的克隆。并且本研究的優勢在于前人對于水稻芽期根數耐冷研究較少，定位出的QTL可以補充苗期根系耐冷QTL數據，為今后聚合耐冷基因，提升育種效率打下堅實基礎。