芯片式數(shù)字PCR（dPCR）檢測(cè)晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）血液EGFR突變的應(yīng)用價(jià)值

冷玉玲，吳奇琛，何章勇，徐進(jìn)，章京紅，吳東平，景奉香（通信作者）

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 腫瘤科，安徽 合肥 230001；2.海軍安慶醫(yī)院 胸外科，安徽 安慶 246003；3.上海奕檢醫(yī)療科技有限公司，上海 200000；4.上海小海龜科技有限公司研發(fā)部，上海 200000）

0 引言

臨床中80%的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），大部分患者在首診后就處于中晚期，傳統(tǒng)治療手段如放化療等對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的治療并不理想[1]。靶向治療是目前非小細(xì)胞肺癌治療的重要手段之一，如EGFRTKI抑制劑，針對(duì)有靶基因敏感突變的患者，治療的有效率會(huì)得到顯著的提高[2]。病理組織樣本是肺癌患者進(jìn)行表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因檢測(cè)的首選標(biāo)本，但實(shí)際檢測(cè)中組織樣本的獲取可能會(huì)受到多種臨床因素的制約，甚至部分患者會(huì)出現(xiàn)無(wú)法獲取組織樣本的情況[2]。目前以EGFR基因?yàn)榇硇园悬c(diǎn)的小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI），是近年來(lái)NSCLC靶向治療的重點(diǎn)，而EGFR基因突變是治療的決定性條件，選擇合適的檢測(cè)方法（例液態(tài)活檢），篩選合適患者進(jìn)行靶向治療是進(jìn)行個(gè)體化精準(zhǔn)治療的目標(biāo)[3]。在腫瘤組織標(biāo)本無(wú)法獲取情況下，國(guó)內(nèi)大多檢測(cè)方法選擇擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）檢驗(yàn)，而dPCR利用外周血循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)，這一新型檢測(cè)方式已經(jīng)獲得了廣泛認(rèn)可[4]。本文將進(jìn)一步分析與討論芯片式數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)于外周血循環(huán)腫瘤DNA的EGFR突變檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料。將2018年1月至2020年1月收治的40例NSCLC患者，含治療后耐藥患者18例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)過(guò)病理組織證實(shí)；②CT檢測(cè)病灶長(zhǎng)徑≥10 mm；③心電圖肝腎功能正常；④知情本文相關(guān)研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①造血功能出現(xiàn)障礙；②妊娠及哺乳期患者。所有患者男18例，女22例，年齡30～80歲，平均（61.54±4.07）歲，患者分布見(jiàn)表1。

表1 患者分布

1.2 方法

（1）所有患者均空腹抽取靜脈血10 mL，耐藥患者在治療后抽取，2000×g離心5 min，取上清液，再次8000×g離心5 min，取上清，置于-20℃保存。

（2）血漿游離DNA提取：按照循環(huán)DNA核酸提取試劑盒（廈門(mén)艾德公司，批號(hào)02216060701X）進(jìn)行操作，使用Qubit2.0熒光定量?jī)x和Agilent 2100生物分析儀，分析DNA濃度與片段大小。以DNA濃度大于20 ng/μL，其中DNA片段為170 bp左右為合格。

（3）ARMS檢測(cè)：使用ABI 7500熒光定量PCR儀及人類(lèi)EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（廈門(mén)艾德公司，批號(hào)01217081601X）檢測(cè)EGFR基因突變，檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并判讀結(jié)果。

（4）dPCR檢測(cè)：使用上海小海龜科技有限公司的BioDigital·青數(shù)字化PCR儀，以及人類(lèi)EGFR（19del/L858R）、EGFR（T790M）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)1863103，1863104，863105，江蘇圣極基因科技有限公司），按照數(shù)字PCR系統(tǒng)及試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)EGFR基因的突變情況，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析與統(tǒng)計(jì)。

1.3 觀察（評(píng)價(jià)）指標(biāo)。分析兩種檢測(cè)方法EGFR基因突變結(jié)果，以及dPCR法檢測(cè)EGFR基因突變豐度結(jié)果[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本文數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARMS法與dPCR法檢測(cè)EGFR基因突變結(jié)果。ARMS法共檢出22例患者，dPCR法共檢出26例患者，其中雙突變患者分別為3例與6例，見(jiàn)表2。

表2 兩種檢測(cè)方法EGFR基因突變結(jié)果

2.2 dPCR法檢測(cè)EGFR基因突變豐度結(jié)果。進(jìn)行EGFR TKI抑制劑治療的患者中，p.T790M位點(diǎn)檢出6例，未進(jìn)行治療的患者均未檢出該位點(diǎn)突變；所有EGFR的突變病例中，突變豐度≥1%的突變位點(diǎn)有23個(gè)，占總突變位71.88%（23/32），突變豐度＜1%，占28.12%（9/32）；接受TKI治療的患者T790M突變數(shù)為6例，豐度＜1%為4例，比例為66.67%（4/10），見(jiàn)表3。

表3 dPCR法檢測(cè)EGFR基因突變豐度結(jié)果

3 討論

近年來(lái)非小細(xì)胞肺癌診療在臨床已經(jīng)有了一定進(jìn)步，患者一旦確診后，需要根據(jù)組織學(xué)與突變信息進(jìn)行分類(lèi)，再依據(jù)治療指南投藥；對(duì)于靶向藥物研究方面進(jìn)展，適合進(jìn)展期患者，在選擇藥物的時(shí)候能夠更加貼合患者實(shí)際情況[6]。而對(duì)肺癌患者進(jìn)行病理組織樣本檢測(cè)，對(duì)后期治療具有重要意義，可是實(shí)際工作中受到多種因素的影響，會(huì)使得檢測(cè)出現(xiàn)一定影響[7]。隨著我國(guó)外周血循環(huán)腫瘤EGFR檢測(cè)的發(fā)展，臨床醫(yī)師也希望有更方便（外周血循環(huán)腫瘤DNA）及靈敏度更好（dPCR）的方法，來(lái)達(dá)到更好的治療提供更好的臨床結(jié)果及愈后，因此對(duì)檢測(cè)方式的要求也在不斷提高[8]。

芯片式數(shù)字PCR（dPCR）能提供更精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果（絕對(duì)定量，精確度達(dá)0.01%）、更低的單次開(kāi)機(jī)成本（單次檢測(cè)樣本通量高）、檢測(cè)費(fèi)用可控制，血液樣本可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，同時(shí)也因?yàn)樘岣吡嘶颊叩闹委熜б娑@益，見(jiàn)表4。

表4 dPCR法與ARMS法檢測(cè)EGFR基因突變對(duì)比

本文通過(guò)將兩種檢測(cè)方法納入研究，結(jié)果顯示：ARMS法共檢出22例患者，dPCR法共檢出26例患者，其中雙突變患者分別為3例與6例。能夠看出dPCR法檢出率較好，本文通過(guò)選擇3主要突變位點(diǎn)，在傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增前，對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，擴(kuò)增技術(shù)后通過(guò)直接計(jì)劃的方法計(jì)算平均濃度[9]。由于dPCR法敏感性較高，暫無(wú)其他可靠的方法驗(yàn)證，是否存在假陽(yáng)性仍存在一定爭(zhēng)議。突變豐度≥1%的突變位點(diǎn)占總突變位71.88%（23/32），突變豐度＜1%占據(jù)28.13%（9/32）；接受治療的患者中，突變豐度＜1%比例為66.67（4/10）。雖然ARMS法也能夠檢出部分突變豐度＜1%的突變位點(diǎn)，但仍有部分低豐度突變的患者無(wú)法檢出，因此在檢測(cè)外周血EGFR基因突變后，尤其是TKI治療后的患者，可用dPCR法檢出更多低豐度突變的患者，使得更多患者更好的接受靶向治療[10]。與臨床使用的ARMS法相比，dPCR法檢測(cè)理論上精確度更好，選擇ARMS法檢測(cè)，判讀結(jié)果期間需要結(jié)合多種因素，包括患者耐受性，醫(yī)生及時(shí)與患者溝通，為了確保結(jié)果可靠更需要重復(fù)進(jìn)行驗(yàn)證[11]。

但本文研究樣本數(shù)較少，僅僅選取2年的患者進(jìn)行研究，可能會(huì)使得研究結(jié)果出現(xiàn)一定偏差，后期臨床需要擴(kuò)大樣本數(shù)量，結(jié)合dPCR可絕對(duì)定量的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)基因突變豐度檢測(cè)，為靶向治療提供重要依據(jù)[12-13]。

綜上所述，非小細(xì)胞肺癌血液EGFR突變檢測(cè)期間，使用dPCR法檢測(cè)準(zhǔn)確度較高，靈敏度高，能夠更好地指導(dǎo)臨床用藥，但在檢驗(yàn)期間存在一定影響因素，因此需要規(guī)范化操作，確保患者更好進(jìn)行治療。