小球藻病毒PBCV-1編碼的Cu,Zn-SOD 酶學穩(wěn)定性

劉建榮賈紅玉陳慧慧劉曉飛康明

(1.河北大學 生物工程技術創(chuàng)新中心,河北 保定 071002；2.河北大學 生命科學學院,河北 保定 071002)

活性氧(reactive oxygen species,ROS)既可以由有氧生物在正常代謝活動中產生,又可以在脅迫條件下產生.生理濃度的ROS有益于生物體本身,并參與信號通路活動以及保護生物免于病原體侵染；但高濃度ROS會破壞生物大分子及細胞結構[1-3],但細胞能利用超氧化物歧化酶(superoxide dismutases,SODs)降解ROS來降低其造成的破壞[4-5].作為金屬蛋白,SODs能將超氧陰離子轉化成較低毒性的過氧化氫和分子態(tài)氧從而保護生物有機體免受有毒活性氧破壞[6].根據(jù)與酶蛋白結合的用于超氧離子淬滅的金屬輔基的不同,SODs被分成銅鋅-超氧化物歧化酶 (Cu,Zn-SOD),鐵-超氧化物歧化酶 (Fe-SOD),錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD),以及鎳-超氧化物歧化酶 (Ni-SOD).哺乳動物細胞中Cu,Zn-SOD 位于細胞質中 (SOD1) 或位于胞外空間 (SOD3),Mn-SOD 位于線粒體 (SOD2)[7]；高等植物通常具有位于線粒體的Mn-SOD、葉綠體的Fe-SOD、細胞質及細胞分室中的多種類型的Cu,Zn-SOD[8]；真核藻類和原生動物細胞通常具有Mn-SOD和Fe-SOD,缺乏Cu,Zn-SOD；原核生物具有Mn-SOD 和/或Fe-SOD,但很多革蘭氏陰性細菌具有Cu,Zn-SOD[9-10].Ni-SOD 只存在于數(shù)種鏈霉菌中[11].病毒極少編碼SODs,但幾類大型DNA 病毒如痘病毒 (poxviruses)、桿狀病毒 (baculoviruses)、擬菌病毒 (mimiviruses) 以及藻類DNA 病毒 (phycodnaviruses)卻編碼Cu,Zn-SOD 狀基因.除了藻類DNA 病毒和一種昆蟲痘病毒外,其他病毒編碼的SODs并未檢測到活性[12-13].藻類DNA 病毒科的模式病毒株paramecium bursaria chlorella virus 1(PBCV-1)及多數(shù)小球藻病毒屬 (chloroviruses) 同屬病毒株都編碼Cu,Zn-SOD 基因；PBCV-1編碼的銅鋅-超氧化物歧化酶 (chlorovirus Cu,Zn-SOD,cvSOD)以及其截短PBCV-1突變體truncated chlorovirus SOD(以下簡稱tcvSOD) 均具有SOD 活性,其基因的表達有可能幫助病毒淬滅宿主產生的ROS,有利于病毒的感染與復制[13].由于SODs能降低ROS水平,減少氧自由基對生物有機體的傷害,具有抗腫瘤、抗炎及提高免疫力的作用,使得其在食品、醫(yī)藥和日化領域的應用受到越來越多的關注[14].本文試圖通過測定小球藻病毒株PBCV-1 編碼的Cu,Zn-SOD 截短突變體tcvSOD 在不同溫度、p H 值、蛋白變性劑脅迫條件下的酶活性及酶學穩(wěn)定性,并進一步評估其應用潛力.tcvSOD 是cvSOD 截短了其N-端的第1個內部甲硫氨酸前面的21個氨基酸殘基后形成的截短突變體,此突變體與野生型相比在大腸桿菌中具有較高的表達量并具有較強的酶活性[13],因此本研究以重組tcvSOD 為材料.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌克隆宿主DH5α和表達宿主BL21 Rosetta(DE3)(Novagen產品)均為本實驗室保存,表達質粒p ET23a(+)(Novagen產品)為本實驗室保存.除特殊標明的以外,本實驗所有試劑均購自國藥集團.

1.2 tcvSOD基因克隆與表達載體構建

根據(jù)GenBank的PBCV-1的cvSOD 序列,從N-端第1個內部甲硫氨酸密碼子開始設計5’端引物.1對擴增引物序列設計為a245r NdeIFrw:CCGCATATGACCAAGAACACATCTTCATTG,a245r XhoIRev:GACCTCGAGACAAA AGTTTTCTTTGGCATA.上述引物由奧科鼎盛生物科技有限公司合成.tcvSOD PCR 產物利用Phanta Super-Fidelity D NA 聚合酶 (Vazyme) 獲得,擴增條件如下:模板95℃預變性30 s,95℃變性15 s,59.3℃退火15 s,72℃延伸60 s,30個循環(huán),補齊延伸10 min.PCR 產物經質量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離,Biomiga膠回收試劑盒純化,Takara Q.cut 限制性內切酶NdeI與XhoI消化,再與同樣經NdeI與XhoI消化的大腸桿菌表達載體p ET23a(+)連接；連接產物轉化大腸桿菌克隆宿主DH5α,經擴增、酶切驗證、測序分析,確定tcvSOD 基因插入到表達載體而獲得重組質粒p ET23a(+)-tcvsod.

1.3 tcvSOD的表達與純化

重組質粒p ET23a(+)-tcvsod導入蛋白表達宿主BL21 Rosetta(DE3),以不含質粒的宿主菌為對照,經0.4 mmol/L的IPTG 誘導、細胞破碎、Ni-NTA resin (Novagen產品) 吸附,結合/裂解緩沖液 (50 mmol/L Na H2PO4,300 mmol/L NaCl,10 mmol/L imidazole,p H 8.0)、洗滌緩沖液 (50 mmol/L Na H2PO4,300 mmol/L NaCl,20 mmol/L imidazole,p H 8.0)、洗脫緩沖液 (50 mmol/L Na H2PO4,300 mmol/L NaCl,250 mmol/L imidazole,p H 8.0) 純化,最終將tcvSOD 收集于含體積分數(shù)50%甘油的洗脫緩沖液中.用分離膠質量分數(shù)12%的SDS-PAGE檢測tcvSOD 的表達與純化結果.

1.4 tcvSOD活性檢測

參照Marklund的鄰苯三酚自氧化法并加以修改[14-15].

1.4.1 鄰苯三酚自氧化速率測定

將999μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液,1 mmol/L二乙三胺五乙酸,p H 8.2,25℃下平衡20 min后迅速加入1μL 45 mmol/L鄰苯三酚溶液(用10 mmol/L HCl配制),鄰苯三酚終濃度為0.045 mmol/L,在320 nm 處進行3 min的時間掃描.通過計算斜率ΔA/Δt得到自氧化速率R,單位為ΔA320/min,其中A為吸光度,t為掃描時間.此方法得到R=0.022/min,落在Marklund建議的用于間接測定SOD 活性的鄰苯三酚自氧化速率0.015～0.025/min內[15].

1.4.2 tcvSOD 活性測定與鄰苯三酚自氧化抑制曲線繪制

在總體積為1 m L反應體系中混合50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (含1 mmol/L的二乙三胺五乙酸,p H 8.2) 和不同質量濃度的tcvSOD 蛋白,25℃平衡20 min 后,加入1μL的45 mmol/L 鄰苯三酚溶液,320 nm 處掃描3 min以獲取R值,并通過調整tcvSOD 加入量達到對鄰苯三酚自氧化速率的最大抑制.在此條件下,SOD 對鄰苯三酚自氧化速率達到最大抑制水平的50%作為SOD 的1個活性單位,也可同時計算SOD 的比活性[16].

式中R0為320 nm 處鄰苯三酚自氧化速率；RS為添加樣品SOD 后鄰苯三酚自氧化速率；V為加樣體積(單位為m L)；N是樣品稀釋倍數(shù).

1.5 酶學穩(wěn)定性實驗

將純化的tcvSOD 適當稀釋,測試在各種脅迫條件下反應體系中tcvSOD 質量濃度分別為0.05、0.1、1μg/m L時的相對酶活性.

溫度:在總體積為1 m L反應體系中混合50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (含1 mmol/L的二乙三胺五乙酸,p H 8.2),適量的tcvSOD蛋白,調整酶蛋白終質量濃度為0.05、0.1、1μg/m L,分別在4、25、37、42、55、65、75、90℃條件下保溫30 min,加入1μL 45 mmol/L鄰苯三酚溶液,320 nm 處掃描3 min進行相對酶活測定.

p H 值:在總體積為1 m L反應體系中分別混合50 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液(p H 4,p H 6)、Tris-HCl緩沖液 (p H 8) 和甘氨酸-NaOH 緩沖液 (p H 10),均含有1 mmol/L的二乙三胺五乙酸,均加入適量的tcv-SOD 蛋白,調整酶蛋白終質量濃度為0.05、0.1、1μg/m L,25℃保溫30 min,以不加酶的反應體系為對照,加入1μL的45 mmol/L鄰苯三酚溶液,與1.4.2相同條件下測定酶活.

變性劑:在總體積為1 m L反應體系中將50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含1 mmol/L的二乙三胺五乙酸,p H 8.2),分別與相應的變性劑(質量分數(shù)2%,4%,6%,8%,10%的SDS；2、4、6、8、10 mol/L的尿素；1、2、3、4 mol/L的鹽酸胍) 混合,加入適量的tcvSOD蛋白,調整酶蛋白終質量濃度為0.05、0.1、1μg/m L,25℃保溫30 min,以不加酶的反應體系為對照,加入1μL的45 mmol/L鄰苯三酚溶液,與1.4.2相同條件下測定酶活.

2 結果與分析

2.1 tcvSOD的大腸桿菌異源表達

與人(GenBank 登錄號NP_000445.1,下同)、牛(NP_777040.1)及黑腹果蠅(CAA35210.1) 的Cu,Zn-SOD 相比,以小球藻病毒PBCV-1編碼的Cu,Zn-SOD具有32個N-端冗余氨基酸殘基,功能不詳,其中第22位是甲硫氨酸.以PBCV-1基因組DNA 為模板,以其編碼的Cu,Zn-SOD N-端22位甲硫氨酸作為起始密碼子設計引物進行截短的SOD 突變體tcvSOD 基因擴增,得到1條約500 bp DNA 條帶,與預期的489 bp產物相符 (圖1a).將tcvSOD 的PCR 產物與載體p ET23a(+)同時用NdeI和XhoI酶切處理、連接、轉化大腸桿菌克隆宿主DH5α,挑取單菌落培養(yǎng)并用Biomiga質粒提取試劑盒提取質粒DNA,經酶切鑒定確定tcvSOD 片段插入到了載體合適位點 (圖1b),最終對tcvSOD 陽性克隆測序確定了插入片段的正確性.經測序驗證的p ET23a(+)-tcvsod轉化大腸桿菌外源蛋白表達載體BL21 Rosetta(DE3),用終濃度為0.4 mmol/L的IPTG 誘導tcvSOD 蛋白表達,并以BL21 Rosetta(DE3)空菌作為陰性對照.對誘導后的菌體細胞進行破碎離心、重組蛋白Ni-NTA 凝膠純化和SDS-PAGE 鑒定,發(fā)現(xiàn)重組tcvSOD 蛋白主要存在于細胞的可溶性組分中,經Ni-NTA 凝膠結合、洗滌、洗脫得到大小約18 ku 的6×His-tcvSOD 重組蛋白(圖1c).經BCA 蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio產品)測定重組蛋白濃度,用洗脫液將重組蛋白稀釋到適當濃度并摻入終體積分數(shù)為50%的甘油備用.

圖1 PBCV-1編碼的tcvSOD基因的克隆與大腸桿菌異源表達Fig.1 Cloning and heterologous over-expression of tcvSOD encoded by Chlorovirus PBCV-1 in Escherichia coli

2.2 tcvSOD對鄰苯三酚自氧化的抑制

采用Marklund[15]的抑制鄰苯三酚自氧化間接測定SOD 活性的方法檢測tcvSOD 酶活性.此方法的原理是鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化,產生多種具不同吸收峰的中間產物且有超氧陰離子的參與,中間產物產量與鄰苯三酚自氧化速率呈正相關.SOD 通過降解超氧陰離子抑制鄰苯三酚自氧化,因此監(jiān)測中間產物吸光度的改變來表示SOD 對鄰苯三酚自氧化的抑制,最終間接推測出SOD 的酶活性.用320 nm 處吸光度檢測鄰苯三酚自氧化產生的中間產物[14,18],具體見實驗方法1.4.2.tcvSOD對鄰苯三酚自氧化有明顯的抑制作用 (圖2),抑制率最高可達97%；在tcv-SOD質量濃度為0.2μg/m L時達到最大抑制.按前述SOD酶活力單位定義計算得到tcvSOD比活力為16 050 U/mg.

2.3 tcvSOD熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性

圖2 tcvSOD對鄰苯三酚自氧化反應的抑制曲線Fig.2 Inhibition curve generated by tcvSOD toward the auto-oxidation of pyrogallol

將反應體系中的tcvSOD 質量濃度分別調整到0.05、0.1、1μg/m L,在4、25、37、42、55、65、75 及90℃下保溫30 min后測定SOD 活性,結果表明,當反應體系中tcvSOD質量濃度為1μg/m L時,酶活性從4～75℃保持恒定,在90℃處理30 min后略有下降；而酶質量濃度為0.1和0.05μg/m L時,酶活性從42℃開始下降,到90℃時幾乎完全失活(圖3a).推測溫度較高時低質量濃度tcvSOD 更容易丟失螯合的Cu2+和Zn2+從而迅速喪失活性,但這一推斷有待實驗證明.上述結果證明,在合適的質量濃度下tcvSOD 具有相當高的熱穩(wěn)定性.變換p H 值從4～12,質量濃度1μg/m L 與0.1μg/m L時tcvSOD 活性維持不變,質量濃度0.05μg/m L樣品只是在p H 12時活性略有降低,表明tcvSOD 在較大p H值范圍內具有穩(wěn)定性(圖3b).

圖3 tcvSOD的熱穩(wěn)定性(a)與酸堿穩(wěn)定性(b)Fig.3 Thermo-stability(a)and p H-stability(b)of tcvSOD

2.4 不同蛋白變性劑對tcvSOD活性的影響

鑒于SOD 在醫(yī)藥和食品等領域有廣泛的應用前景,體外檢測SOD 在各種變性劑脅迫下的酶活穩(wěn)定性就顯得十分必要.在本文實驗條件下,終質量濃度1μg/m L的tcvSOD,其活性在質量分數(shù)2%～8%SDS作用下維持穩(wěn)定,質量分數(shù)10%SDS導致酶活性的輕微喪失；酶質量濃度0.1μg/m L 和0.05μg/m L 時對SDS處理非常敏感,殘留酶活性降到20%以下；質量分數(shù)10%SDS處理下酶活性幾乎完全喪失(圖4a).與SDS處理相反,3種不同質量濃度的tcvSOD 對2～10 mol/L尿素 (圖4b) 與1～4 mol/L鹽酸胍 (圖4c)處理不敏感,無論是質量濃度0.05μg/m L還是1μg/m L的酶蛋白,在實驗條件下均維持活力不變.表明小球藻病毒株PBCV-1編碼的Cu,Zn-SOD 截短突變體tcvSOD 重組蛋白可抵抗較高濃度的蛋白變性劑尿素(10 mol/L)和鹽酸胍 (4 mol/L) 脅迫；當酶質量濃度達到1μg/m L 時也能抵抗較高質量分數(shù)的SDS(10%)脅迫.

圖4 變性劑對tcvSOD酶活性的影響Fig.4 Effects of protein denaturants on the enzymatic activity of tcvSOD

3 討論

包括PBCV-1在內的小球藻病毒是大型DNA 病毒如痘病毒、桿狀病毒、擬菌病毒和藻類DNA 病毒中極少數(shù)編碼有活性SOD 的病毒；PBCV-1的Cu,Zn-SOD 基因表達可能有助于病毒降解宿主產生的ROS,利于病毒的感染與復制.其截短突變型tcvSOD 基因克隆到表達載體p GEX-2T 上,并利用大腸桿菌BL21表達出的可溶性重組蛋白具有典型的Cu,Zn-SOD 特征,例如活性受KCN 強烈抑制[14].p GEX 系列以28 ku的谷胱甘肽S轉移酶 (GST) 作為標簽蛋白,為了免除去標簽蛋白步驟,方便進一步進行tcvSOD 酶學性質研究,本文重新構建了p ET23a(+)-tcvsod重組表達載體,成功表達純化了帶有6×His標簽的可溶性重組tcvSOD.該蛋白對鄰苯三酚自氧化有明顯的抑制作用,抑制率最高可達97%,表現(xiàn)出典型的SOD 酶活特征,并且在質量濃度為0.2μg/m L時達到最大抑制.重組tcvSOD 活性對環(huán)境因素脅迫的反應與酶濃度有一定關系,例如終質量濃度為1μg/m L時90℃處理30 min,tcvSOD 相對酶活性仍可達到90%；而酶質量濃度0.1和0.05μg/m L時,42℃下酶活開始下降,90℃時幾乎完全喪失；同樣質量濃度1μg/m L的tcvSOD 在質量分數(shù)2%～10%SDS脅迫下活性相對穩(wěn)定,而質量濃度為0.1和0.05μg/m L 時對SDS脅迫非常敏感.與上述情況相反,3種質量濃度的tcvSOD 在p H 4～10內均基本保持穩(wěn)定的活性,表明它有較寬泛的p H 穩(wěn)定性；同樣,各種質量濃度的tcvSOD 其活性不受2～10 mol/L 尿素和1～4 mol/L 鹽酸胍脅迫的影響.上述結果均表明,tcvSOD 具有進一步開發(fā)應用的潛能.鑒于SOD 在醫(yī)藥、食品、化妝品以及農業(yè)領域有廣闊的應用潛力,而在化妝品行業(yè)已經有了廣泛的應用[19-22],開發(fā)挖掘具有高活性、耐熱耐酸堿、對變性劑及酶解有強抵抗力的SOD 就顯得十分必要.無論是純化自天然的組織細胞中的SODs(如沙丁魚[23]、山羊[24]、克魯維酵母[25]),還是用微生物表達的重組SOD(如南極毛草[26]),小球藻病毒PBCV-1編碼的tcv-SOD 與它們相比,在穩(wěn)定性和對脅迫的抗性方面都顯得比較突出,因此具有進一步開發(fā)利用的價值.

致謝:對河北大學生物工程技術創(chuàng)新中心的杜建芳副研究員在該論文研究中給予的幫助表示感謝.