丹參酮ⅡA通過AK003290減輕H 2O2誘導的原代小鼠心肌細胞焦亡*

易 娜，李 賀，游三麗，袁李禮△

（1長沙市第四醫院心內科，2湖南省腦科醫院心內科，湖南長沙410007）

隨著人口老齡化的進展，心血管疾病的發病率和死亡率呈逐年上升趨勢［1］，在心肌缺血、梗死和衰竭等心血管疾病的發生發展中均存有心肌細胞損傷［2］。氧化應激是心肌損傷發生的重要機制之一［3］，大量產生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）能導致心肌細胞損傷［4］。而細胞焦亡是不同于凋亡和壞死的一種新的細胞程序性炎性死亡方式［5］，抑制焦亡能夠減輕心肌細胞損傷，減少炎癥因子產生并抑制炎癥反應［6］。研究報道，過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導的心肌損傷模型中存有明顯的焦亡［7］。焦亡常始于炎癥小體的形成，氧化應激產生的ROS能活化NLRP3炎性小體從而參與細胞焦亡通路的激活［8］。

丹參酮ⅡA（tanshinone IIA，TAN）是傳統中藥丹參的脂溶性提取物，通過抗炎、抗氧化和抗凋亡等機制在多種心血管疾病中發揮保護作用［9］，還能通過調控多種長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）發揮其藥理學作用。有研究報道在H2O2誘導的心肌細胞損傷中，lncRNA AK003290表達降低［10］。AK003290在心臟和肌組織中高表達，能影響肌細胞的增殖分化功能［11］。丹參酮ⅡA能否通過調控AK003290影響心肌細胞焦亡尚不明確。因此，本研究構建H2O2誘導的原代小鼠心肌細胞損傷模型，以lncRNA和細胞焦亡作為切入點，探討丹參酮ⅡA通過AK003290調控H2O2誘導的心肌細胞焦亡的影響及其機制，為丹參酮ⅡA在心血管疾病中的應用提供實驗依據。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 1～3日齡的SPF級C57乳鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號為430727201101314623，實驗單位許可證號為SYXK（湘）2019-0009，動物實驗符合湖南省腦科醫院實驗動物倫理標準。

1.2 主要試劑 丹參酮ⅡA（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；M199培養液和胎牛血清（Gibco）；CCK-8試劑盒［東仁化學科技（上海）有限公司］；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性檢測試劑盒（南京建成生物研究所）；Trizol、逆轉錄試劑盒和SYBR Green試劑盒（Invitrogen）；膠原酶和BCA蛋白定量試劑盒（Sig‐ma）；小鼠白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 ELISA試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）；兔抗小鼠GSDMD和caspase-1抗體（Cell Signaling Tech‐nology）；caspase-1活性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；ECL化學方法試劑盒（Pierce）。

1.3 主要儀器 CO2培養箱（Thermo Scientific）；酶標儀（BioTek）；熒光定量PCR儀器（Applied Biosystems）；電泳儀、轉膜儀和化學發光成像儀器（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 原代小鼠心肌細胞提取 取1～3日齡的C57乳鼠，75%乙醇消毒后處死，取出心臟并去除血塊，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm，加入0.1 mmol/L膠原酶，37℃震蕩孵育1 h，細胞篩過濾后300×g離心5 min收集細胞，用含0.1 mmol/L的5-BrdU和10%胎牛血清的M199培養基重懸后差異貼壁法收集心肌細胞，2～3 h后待成纖維細胞貼壁后輕吹培養基并轉移至新培養瓶中，培養48 h后進行實驗處理。

2.2 心肌細胞損傷模型的建立和丹參酮ⅡA處理

依照作者前期研究基礎［12］選用20、40和60μmol/L的丹參酮ⅡA預處理12 h，采用100μmol/L的H2O2處理12 h誘導心肌細胞損傷模型［13］。每組設置6個復孔，重復3次。

2.3 實驗分組 （1）對照（control）組、H2O2組（H2O2處理12 h）及不同濃度的丹參酮ⅡA組（20、40和60μmol/L丹參酮ⅡA預處理12 h+H2O2處理12 h）；（2）對照（control）組、H2O2組（H2O2處理12 h）、丹參酮ⅡA組（40μmol/L丹參酮ⅡA預處理12 h+H2O2處理12 h）和siAK003290+丹參酮ⅡA組（siAK003290轉染+40μmol/L丹參酮ⅡA預處理12 h+H2O2處理12 h）。

2.4 siAK003290細胞轉染和干擾序列的篩選 由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成2條序列（siAK003290-1：5'-ATCTGTACTACAAACTAAAAA‐CA-3'；siAK003290-2：5'-GGAUGCAGUCACAUCU‐GUACU-3'）和1條NC-siRNA序列。siRNA用無酶水配制成20μmol/L，待細胞融合度達30～50%時進行轉染，按Lipofectamine 2000轉染說明書操作。轉染效率評估通過real-time PCR檢測AK003290表達來進行，選擇效果較好的siRNA用于后續實驗。每組設置6個復孔，重復3次。轉染12 h后進行后續分組和實驗處理。

2.5 細胞活力檢測 細胞接種于96孔板，分組和處理同前。每孔加入10μL的CCK-8試劑，37℃孵育1 h后，使用酶標儀測定450 nm的吸光度（A）值，每組設置6個復孔，重復3次。

2.6 細胞抗氧化酶活性檢測 細胞接種于6孔板，分組和處理同前。收集細胞上清，依照SOD活性檢測試劑盒（羥胺法）和CAT活性檢測試劑盒（鉬酸銨法）說明書進行操作，計算樣品濃度，每組設置6個復孔，重復3次。

2.7 real-time PCR檢測AK003290表達 細胞接種于6孔板，分組和處理同前。PBS清洗細胞，Trizol裂解液提取總RNA，再將RNA逆轉錄成cDNA。采用SYBR Green方法對cDNA行熒光定量PCR擴增AK003290及內參照GAPDH。AK003290的正向引物序列為5'-CAAGCTCTTCCAGATATGGTG-3'，反向引物序列為5'-ACCTTTGGTATGCCTTTCCAC-3'；GAPDH的正向引物序列為5'-TGTGTCCGTCGTG‐GATCTG-3'，反向引物序列為5'-CCTGCTTCAC‐CACCTTCTTG-3'。根據2?ΔΔCt計算AK003290的相對表達量。每組設置6個復孔，重復3次。

2.8 Western blot檢測細胞焦亡相關蛋白GSDMD和caspase-1表達 細胞接種于6孔板，分組和處理同前。用PBS緩沖液清洗細胞，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量后煮沸變性。蛋白經12%的SDSPAGE分離后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入Ⅰ抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，Ⅱ抗（1∶3 000）室溫孵育1 h。ECL化學發光并成像采集，以GADPH作為內參照采用Image Lab分析蛋白相對表達水平。每組設置3個復孔，重復3次。

2.9 ELISA檢測細胞培養上清IL-1β和IL-18含量

細胞接種于96孔板，分組和處理同前。300×g離心5 min收集上清，依照ELISA試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀測定450 nm的A值，根據標準品濃度繪制標準曲線，計算樣品濃度，每組設置6個復孔，重復3次。

3 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。GraphPad Prism 8軟件進行圖形繪制。數據采用均數±標準差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行多組間比較，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 丹參酮ⅡA能減輕H 2O2誘導的原代小鼠心肌細胞損傷

與control組相比，H2O2組原代小鼠心肌細胞活力及抗氧化酶SOD和CAT活性均顯著降低（P<0.01）；與H2O2組相比，不同濃度的丹參酮ⅡA組細胞活力及SOD和CAT活性顯著升高（P<0.05）；其中40和60μmol/L丹參酮ⅡA組的細胞活力及SOD和CAT活性顯著高于20μmol/L丹參酮ⅡA組（P<0.05），而40和60μmol/L丹參酮ⅡA組之間細胞活力及SOD和CAT活性無顯著差異（P>0.05），見圖1。

Figure 1.The effect of tanshinone IIA（TAN）on the viability and antioxidant enzyme activity in H 2O2-treated primary mouse cardio‐myocytes.A：cell viability detected by CCK-8 assay；B：superoxide dismutase（SOD）activity；C：catalase（CAT）activi‐ty.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs H2O2 group；△P<0.05 vs40μmol/L TANgroup.圖1 丹參酮ⅡA對H 2O2處理的原代小鼠心肌細胞活力和抗氧化酶活性的影響

2 丹參酮ⅡA抑制H 2O2誘導的原代小鼠心肌細胞焦亡

與control組相比，H2O2組原代小鼠心肌細胞焦亡相關蛋白GSDMD和caspase-1表達顯著增多，細胞上清IL-1β和IL-18含量顯著增加（P<0.01）；與H2O2組相比，不同濃度丹參酮ⅡA組GSDMD和caspase-1的表達顯著減少，細胞上清IL-1β和IL-18含量顯著降低（P<0.05），見圖2。

3 丹參酮ⅡA促進AK 003290表達以及敲減AK003290的效果驗證

Figure 2.The effect of tanshinone IIA（TAN）on the pyroptosis of H2O2-induced primary mouse cardiomyocytes.A：GSDMD and cas‐pase-1 protein expression；B and C：IL-1βand IL-18 levels in cell supernatant.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs H2O2 group；△P<0.05 vs20μmol/L TANgroup；&P<0.05 vs40μmol/L TANgroup.圖2 丹參酮ⅡA對H 2O 2誘導的原代小鼠心肌細胞焦亡的影響

與control組相比，H2O2組原代小鼠心肌細胞AK003290表達顯著減少（P<0.05）；與H2O2組相比，不同濃度丹參酮ⅡA組細胞AK003290表達增多（P<0.05）；且40和60μmol/L丹參酮ⅡA組的細胞AK003290表達顯著高于20μmol/L丹參酮ⅡA組（P<0.05），見圖3A。結合CCK-8和細胞焦亡結果，選用40μmol/L濃度用于后續實驗。

與si-NC相比，siAK003290-1和siAK003290-2均能降低原代小鼠心肌細胞AK003290表達（P<0.05或P<0.01），其中siAK003290-2的敲減效果更為顯著，見圖3B，因此選用該siRNA用于后續實驗。

4 敲減AK003290減弱丹參酮ⅡA對原代小鼠心肌細胞損傷的抑制作用

與丹參酮ⅡA組相比，siAK003290+丹參酮ⅡA組的原代小鼠心肌細胞活力及抗氧化酶SOD和CAT活性均顯著降低（P<0.05），見圖4。

5 敲減AK003290減弱丹參酮ⅡA對原代小鼠心肌細胞焦亡的抑制作用

與丹參酮ⅡA組相比，siAK003290+丹參酮ⅡA組的原代小鼠心肌細胞心肌細胞焦亡顯著升高，表現為焦亡相關蛋白GSDMD和caspase-1表達顯著增多（P<0.05），細胞上清IL-1β和IL-18含量顯著增加（P<0.05），見圖5。

討 論

氧化應激在心血管疾病發展過程中的重要作用越來越受到關注，其可引起心肌缺血、心肌缺血再灌注損傷以及心肌重構等一系列病理過程的發生，最終導致心肌細胞壞死和凋亡。心肌細胞是高度分化的細胞，不可再生，因此干預氧化應激和減少心肌細胞損傷成為心血管疾病治療的研究熱點。本研究采用H2O2構建原代小鼠心肌細胞損傷模型，研究結果顯示H2O2誘導后原代小鼠心肌細胞活力顯著降低，同時存在抗氧化酶SOD和CAT活性顯著降低，表明心肌細胞發生氧化損傷，與前人的研究一致［14］。

丹參酮ⅡA為唇形科植物丹參主要的脂溶性成分，其心血管保護作用突出［15］。研究報道丹參酮ⅡA具有抗氧化作用，能對抗阿霉素或內毒素誘導的心肌細胞損傷［12，16］。本研究結果表明丹參酮ⅡA也能增強SOD和CAT活性，減輕H2O2誘導的心肌細胞氧化損傷，表明丹參酮ⅡA同樣能減輕H2O2誘導的心肌細胞損傷，這與Xu等［17］的研究結果一致，但具體機制尚不未完全闡明。

Figure 3.The effect of tanshinone IIA（TAN）on the AK003290 expression in H2O2-induced primary mouse cardiomyocytes（A）and the effect of siRNA transfection on the AK003290 expression in primary mouse cardiomyocytes（B）.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs H2O2 group；△P<0.05 vs40μmol/L TANgroup；▲P<0.05，▲▲P<0.01 vs siNCgroup.圖3 丹參酮ⅡA對H 2O 2誘導的原代小鼠心肌細胞AK 003290表達的影響及敲減AK003290的效果驗證

Figure 4.The effect of siAK003290 on the protection of tanshinone IIA（TAN）on viability and antioxidant enzyme activity in H 2O2-in‐duced primary mouse cardiomyocytes.A：cell viability detected by CCK-8 assay；B：superoxide dismutase（SOD）activi‐ty；C：catalase（CAT）activity.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs H2O2 group；△P<0.05 vs TAN+H2O2 group.圖4 siAK 003290對丹參酮ⅡA保護H 2O 2誘導的原代小鼠心肌細胞活力和抗氧化酶活性的影響

近年來，研究證實細胞焦亡在心肌損傷中發揮重要作用，氧化應激產生的ROS活化炎癥小體，介導細胞焦亡，加重心肌細胞損傷［18］。經典的細胞焦亡途徑依賴caspase-1介導［19］，caspase-1切割IL-1β、IL-18及GSDMD，導致細胞炎癥和焦亡。細胞焦亡時發生IL-1β和IL-18釋放顯著增加，而GSDMD則被認為是細胞焦亡信號通路的關鍵分子，其表達差異可以用來評估細胞焦亡的程度［20］。本研究結果顯示，H2O2誘導原代小鼠心肌細胞焦亡相關蛋白GSDMD和caspase-1表達顯著增加，同時炎癥因子IL-1β和IL-18釋放增多，表明H2O2誘導的原代小鼠心肌細胞損傷模型存有細胞焦亡，這與葉艷瓊等［7］報道的一致。而丹參酮ⅡA能夠逆轉上述細胞焦亡指標的改變，說明丹參酮ⅡA能抑制H2O2誘導原代小鼠心肌細胞焦亡。但Tong等［21］報道丹參酮ⅡA能增強細胞焦亡并抑制宮頸癌Hela細胞增殖，這與本研究中丹參酮ⅡA對焦亡的調控效果相反，這種調控效果的差異可能與細胞和疾病類型不同有關。

Figure 5.The effect of siAK003290 on the protection of tanshinone IIA（TAN）on pyroptosis of H2O2-induced primary mouse cardio‐myocytes.A：GSDMD and caspase-1 protein expression；B and C：IL-1βand IL-18 levels in cell supernatant.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs H2O2 group；△P<0.05，△△P<0.01 vs TAN+H2O2 group.圖5 siAK003290對丹參酮ⅡA保護H 2O2誘導的原代小鼠心肌細胞焦亡的影響

研究報道丹參酮ⅡA能調控多種lncRNA發揮其藥理學作用［22］，Liu等［10］報道H2O2誘導的心肌細胞損傷中lncRNA-AK003290表達降低，AK003290在心臟和肌組織中高表達，影響肌細胞的增殖和分化［23］。本研究結果顯示丹參酮ⅡA能部分恢復H2O2誘導AK003290低表達，但丹參酮ⅡA是否通過調控AK003290影響H2O2誘導原代小鼠心肌細胞氧化損傷和焦亡，目前尚不清楚。本研究結果顯示采用siRNA干擾心肌細胞AK003290表達后，丹參酮ⅡA對H2O2誘導心肌細胞氧化損傷的保護作用受到限制，同時細胞炎癥和焦亡也顯著提升，提示AK003290在丹參酮ⅡA對抗H2O2心肌細胞損傷和焦亡中起作用。丹參酮ⅡA如何調控AK003290及其調控靶點并不清楚，Zhang等［24］報道丹參酮ⅡA能通過lncRNA-HOTAIR/核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，NRF2）減輕對乙酰氨基酚引起的肝毒性。而NRF2是調控細胞氧化應激反應的重要轉錄因子，Yan等［25］報道丹參酮ⅡA能夠激活NRF2而減輕心肌細胞氧化損傷，我們推測丹參酮ⅡA也可能通過AK003290調控NRF2，但有待于進一步實驗研究證實。

綜上所述，丹參酮ⅡA通過上調AK003290抑制H2O2誘導的心肌細胞氧化損傷和焦亡，發揮其心肌細胞保護作用。本研究可為丹參酮ⅡA的心血管疾病中應用提供實驗依據。