回陽生肌湯對糖尿病小鼠皮膚創面愈合及單核巨噬細胞表型轉化的影響*

陳 佳，劉青武，韓旭陽，劉 欣，林 燕，馬慧可，何秀娟△，李 萍△

（1北京中醫藥大學，北京100029；2北京中醫醫院，北京市中醫研究所，北京100010）

慢性皮膚潰瘍臨床上多指經2周以上治療未能愈合，也無愈合傾向的創面，該病住院患者占外科住院患者的1.5%～3.0%，其中因糖尿病者占32.6%，臨床發病率高，病理機制復雜，為一種難治性皮膚疾病［1］。現臨床上使用清創換藥、植皮、生長因子和干細胞技術等進行治療［2］，能取得一定的治療作用，但治療周期長，費用昂貴，復發率高，給患者帶來巨大精神壓力和經濟負擔［3］。因此，尋找一種療效顯著、經濟負擔小、患者易于接受的治療方法是亟待解決的臨床問題。而中醫藥顯示出顯著優勢，其組合協調作用和低副作用已成為慢性皮膚潰瘍替代療法研究的熱點。回陽生肌湯（Hulyang-Shengji decoction，HYSJD）是經北京中醫醫院名老中醫趙炳南、王玉章臨證總結，現被呂培文發展而來的臨床經驗方。回陽生肌湯能顯著改善創面微環境，促使創面由晦暗變鮮活，加速創面愈合［4-5］，且臨床成本低，副作用小。

單核巨噬細胞在慢性皮膚潰瘍創面愈合過程中發揮著關鍵作用，近年來被研究者重視。Ly6Chi/+促炎型單核細胞在單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的作用下被大量募集到局部創面，Ly6Clow/?單核細胞募集減少，導致創面中M1促炎型巨噬細胞聚集，M2抗炎型巨噬細胞減少，驅動創面慢性炎癥，并損害糖尿病傷口愈合［6］。但目前有關回陽生肌湯通過調控單核細胞的動員、募集和表型轉化來影響創面愈合的研究還鮮見報道。

本實驗通過db/db糖尿病小鼠構建慢性皮膚潰瘍動物模型，研究回陽生肌湯對慢性皮膚潰瘍的治療作用，探討其是否通過調節Ly6Chi/+/Ly6Clow/?單核細胞的動員和募集，增加創面中M2型巨噬細胞來源，從而加速慢性皮膚潰瘍的傷口愈合，進一步揭示回陽生肌湯可能的作用機制，為回陽生肌湯的推廣應用提供參考資料。

材料和方法

1 動物

db/db糖尿病小鼠為無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級小鼠，雄性，8～12周齡，35～40 g；db/m小鼠，SPF級，雄性，6～8周齡，20～22 g。這2種小鼠均購于江蘇常州卡文斯實驗動物有限公司［許可證號：SCXK（蘇）2016-0010］，已通過北京市倫理委員會批準。所有小鼠在清潔、安靜、通風良好的環境中飼養，溫度20～22℃，相對濕度40%～60%，12 h光照/12 h避光循環飼養，自由飲食、飲水，定期更換墊料，定期清理、消毒鼠籠。無菌手術在北京市中醫研究所動物房內進行。

2 實驗藥物

回陽生肌湯飲片由首都醫科大學附屬北京中醫醫院中藥房提供，由北京市中醫研究所制劑室負責質量控制。臨床常用回陽生肌湯組成：生黃芪30 g、炒白術10 g、茯苓20 g、蒼術10 g、肉桂10 g、附子10 g、鹿角霜10 g、木瓜10 g、白芥子10 g、當歸10 g、熟地10 g和北沙參15 g。重組人堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自Pe‐proTech。

3 主要試劑和儀器

明膠海綿購自南京金陵制藥廠；一次性無菌敷料貼購自山東東華醫療科技有限公司；多重免疫熒光抗體：CD68、精氨酸酶1（arginase-1，ARG-1）、清道夫受體CD163和誘導型一氧化氮合酶（inducible ni‐tric oxide synthase，iNOS）抗體購自Abcam；炎癥因子蛋 白 芯 片（GSM-INF-1：mouse inflammation Array GSI）購自RayBiotech；單核細胞流式細胞術相關抗體CD45-APC/Cyanine7、Ly6C-PE、Ly6G-FITC、Viability staining solution-7-AAD和CD115-PE-Cyanine7均購自BioLegend。流式細胞儀購自BD；血糖儀購自三諾公司。

4 主要方法

4.1 藥物配制 回陽生肌湯凍干粉制備：加入生藥總克數8倍體積的超純水，浸泡30 min，大火加熱煮沸后過濾，再加入生藥總克數6倍體積的超純水再次煎煮，大火煮沸后，文火繼續煎煮30 min，過濾后合并兩次收集的濾液；經過醇沉法獲得精制液，進行真空冷凍干燥，得到凍干粉制劑，儲存于干燥罐中備用。根據人、小鼠體表面積換算公式，使用蒸餾水將回陽生肌湯凍干粉配成終濃度為2.325 kg/L的均勻懸液。使用1%胎牛血清將bFGF配成終濃度為3.6 mg/L的溶液，置于?20℃冰箱保存備用。

4.2 回陽生肌湯含藥血清質譜分析 使用高效液相色譜-質譜法（HPLC-MS）對回陽生肌湯含藥血清進行質譜分析。色譜分離采用Thermo Scientific的U3000快速液相色譜，使用反相色譜和親水色譜對血清樣本進行分析。質譜分析采用裝備熱電噴霧離子源的四極桿軌道離子阱質譜儀。數據采集和靶向代謝物定量處理由Xcalibur 2.2 SP1.48軟件操作。

4.3 糖尿病小鼠一般表現及血糖值檢測 小鼠適應性飼養7 d，觀察小鼠飲食、飲水、排尿、活動等習慣，于造模前稱重，剪尾檢測血糖值。

4.4 實驗動物分組、模型制備及給藥 參照經典的背部皮膚全層切除術制備慢性皮膚潰瘍小鼠模型［7］。小鼠戊巴比妥鈉麻醉后，背部剃毛，碘伏消毒，制備背部直徑6 mm全層皮膚切除傷口，距離背部中線和四肢等距離，單籠飼養。將30只db/db糖尿病小鼠隨機分為3組：模型組、回陽生肌湯組和bFGF組。空白對照組采用與db/db糖尿病小鼠相同背景的db/m小鼠。每組各10只小鼠。空白對照組和模型組每日蒸餾水0.4 mL灌胃，外用含50μL生理鹽水的明膠敷料；回陽生肌湯組每日回陽生肌湯凍干粉懸液0.4 mL灌胃，外用含50μL生理鹽水的明膠敷料；bFGF組每日蒸餾水0.4 mL灌胃，外用含50μL bFGF的明膠敷料。灌胃每天1次，隔日換藥，外用一次性無菌敷料貼包扎。采用數碼照相拍照方法記錄創面愈合情況。

4.5 皮膚創面愈合率 數碼照相機采集的圖片采用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件分析，統計小鼠治療后第1、3和7天創面面積，計算創面愈合率。創面愈合率（%）=（給藥前創面面積?未愈合創面面積）/給藥前創面面積×100%。

將通州區的農村路網規模控制在通過以上測算得到的結果范圍內，繼而進行副中心背景下的農村公路的布局方案，本文主要介紹以下幾種典型情況.

4.6 創面組織病理學觀察 傷口皮膚取材后，10%甲醛溶液固定48 h，脫水、石蠟包埋，以5μm為厚度切片。將脫水后的切片進行脫蠟至水，蘇木素侵染5 min，流水沖洗5 min后，鹽酸分化5 s，伊紅染液侵染5 min，流水沖洗5 min后多余軟料后，樹脂封片后進行拍照。利用Aperio Image Scope軟件分析處理圖片。觀察創面皮膚表皮細胞爬行、炎癥細胞浸潤及肉芽組織新生情況。

4.7 多重免疫熒光檢測傷口組織中M1型和M2型巨噬細胞數量 石蠟切片（3μm）用磷酸鹽緩沖溶液洗滌15 min×2次，0.2%～0.5%Triton X-100通透，5%正常馬血清封閉1 h，使用CD68、ARG-1、CD163和iNOSⅠ抗過夜孵育，孵育Ⅱ抗后封片。使用Stra‐ta Quest軟件對切片中的巨噬細胞免疫熒光標記進行自動檢測和定量。圖像處理：對整個圖像進行重構，并對全部結構進行分割。在核識別和篩選的基礎上，分析巨噬細胞表面CD68、Arg1、CD163和iNOS蛋白表達情況，統計分析M1和M2型巨噬細胞數量占總巨噬細胞細胞數的百分比（%）。

4.8 蛋白芯片檢測創面細胞因子的表達 將創面皮膚組織裂解后，采用蛋白定量試劑盒（BCA法）檢測細胞裂解液蛋白濃度。采用Cy3或綠色通道（激發光波長為532 nm）掃描，將得到的原始數據經Ray‐biotech軟件進行芯片背景去除和芯片間歸一化處理，選擇歸一化后的數據進行統計分析。分析方法為矯正t檢驗（moderatedt-statistics）；數據包為limma（R/Bioconductor）；采用P值（P<0.05）和logFC（表達差異倍數，以2為底，logFC>log21.2，差異閾值為1.2）對差異蛋白進行篩選。

4.9 流式細胞術檢測小鼠股骨骨髓和血液中總單核細胞、Ly6Clow/?單核細胞和Ly6Chi/+單核細胞比例分別收集小鼠單側脛股骨骨髓、血液中的總細胞。使用紅細胞裂解液裂解10 min，調整細胞數以每管106/100μL，加入CD45-APC/Cyanine7（0.25μg/106）、CD115-PE-Cyanine7（0.125μg/106）、Ly6G-PE（0.25μg/106）和Ly6C-FITC（0.25μg/106）流式抗體，4℃避光孵育30 min，使用500μL的PBS重懸，上機前加入Viability staining solution-7-AAD（每管5μL）待檢。在CD45+CD115+單核細胞中篩選出Ly6Clow/?和Ly6Chi/+單核細胞。

5 統計學處理

實驗數據采用SPSS 22.0統計軟件進行分析。計量資料使用均數±標準差（mean±SD）表示，進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊者兩兩差異比較用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。圖片繪制使用Prism 8.0版本。

結 果

1 回陽生肌湯含藥血清主要成分

回陽生肌湯含藥血清主要成分為毛蕊異黃酮（calycosin）、毛蕊黃酮苷（calycosin-7-glucoside）、次芒柄花素（formononetin）、芥子酸（sinapic acid）和次烏頭堿（hypaconitine），見圖1。

2 糖尿病小鼠一般表現及血糖值檢測

db/db小鼠平均體重為40 g，顯著高于空白對照組的db/m小鼠（P<0.01），見圖2A；db/db小鼠貪食、多飲、多尿，飼養籠墊料潮濕，行動遲緩。db/m小鼠平均血糖濃度8 mmol/L，db/db糖尿病小鼠平均血糖濃度26 mmol/L，顯著高于db/m小鼠（P<0.01）；db/db糖尿病小鼠各組間血糖濃度的差異無統計學意義（P>0.05），見圖2B。

3 回陽生肌湯對db/db糖尿病小鼠創面愈合率的影響

結果顯示，db/m空白對照組第3和7天創面愈合率分別為64.08%和82.95%，模型組第3和7天創面愈合率分別為24.14%和41.58%，模型組創面愈合率顯著低于空白對照組（P<0.01）；回陽生肌湯干預后第3和7天創面愈合率分別為37.56%和61.17%，顯著高于模型組（P<0.01）；陽性對照bFGF組第3和7天創面愈合率分別為38.08%和59.41%，與回陽生肌湯相比無統計學差異（P>0.05），見圖3。

4 回陽生肌湯對db/db糖尿病小鼠創面組織病理學改變的影響

創面愈合第7天，各組創面邊緣均開始出現表皮細胞爬行，但創面均未完全愈合：空白對照組創面肉芽組織形成，同時見大量成纖維細胞和新生毛細血管，大量纖維排列整齊；模型組表皮爬行緩慢，細胞稀疏，肉芽組織新生減少，成纖維細胞和血管新生稀少；回陽生肌湯組可見表皮細胞增生向中間延伸，新生肉芽組織致密，成纖維細胞和毛細血管豐富，新生成纖維排列整齊，bFGF組與回陽生肌湯組改變一致，見圖4。

5 回陽生肌湯對db/db糖尿病小鼠創面M 1和M 2型巨噬細胞數量的影響

CD68、ARG-1、CD163和iNOS分別為總巨噬細胞、M2a型巨噬細胞、M2c型巨噬細胞和M1型巨噬細胞的標志性分子。在整個創面組織中，空白對照組M1型巨噬細胞（CD68+iNOS+ARG-1?CD163?）和M2型巨噬細胞（CD68+iNOS?ARG-1+CD163+）分別占總巨噬細胞（CD68+）的4.02%和2.48%；模型組M1和M2型巨噬細胞分別占總巨噬細胞的31.60%和0.76%，與空白對照組相比，模型組M1型數量顯著增多，M2型顯著減少（P<0.01）；回陽生肌湯組M1和M2型巨噬細胞分別占總巨噬細胞的6.10%和14.75%，與模型組相比，M1型數量顯著減少，M2型顯著增多（P<0.01）；bFGF組M1和M2型巨噬細胞分別占總巨噬細胞的5.24%、10.28%，與模型組相比，M1型數量顯著減少，M2型顯著增多（P<0.01），與回陽生肌湯組相比，M1和M2型數量均無顯著差異（P>0.05），見圖5。

6 回陽生肌湯對db/db糖尿病小鼠創面M 1和M 2型細胞因子的影響

結果顯示，與空白對照組相比，模型組白細胞介素1α（interleukin-1α，IL-1α）、IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、TNF受體Ⅱ（TNF receptor II，TNF-RII）、MCP-1和干擾素γ（interferonγ，IFN-γ）表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；與模型組相比，回陽生肌湯組IL-1β、IL-1α、IFN-γ、TNF-α、TNF-RII和MCP-1表達水平顯著降低（P<0.05或P<0.01），bFGF組TNF-RII和IL-1α表達水平顯著降低（P<0.01），但IFN-γ、TNF-α和MCP-1表達水平顯著升高（P<0.05或P<0.01），IL-1β表達無顯著差異（P>0.05），見圖6。

Figure 1.The mass spectrumanalysis of the medicated serum of Huiyang-Shengjidecoction.圖1 回陽生肌湯含藥血清質譜分析圖

Figure 2.Body weight（A）and random blood glucose（B）of the mice in each group.Ctrl：control；HYSJD：Huiyang-Shengjidecoc‐tion；bFGF：basic fibroblast growth factor，as positive control.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group.圖2 各組小鼠體重和隨機血糖檢測值

7 回陽生肌湯對db/db糖尿病小鼠骨髓和血液總單核細胞及Ly6Clow/?和Ly6Chi/+單核細胞比例的影響

與空白對照組相比，模型組骨髓總單核細胞和Ly6Clow/?單核細胞比例下降，Ly6Chi/+單核細胞比例升高（P<0.05或P<0.01），血液中總單核細胞和Ly6Chi/+單核細胞比例升高，Ly6Clow/?單核細胞比例下降（P<0.05或P<0.01）；與模型組相比，回陽生肌湯組骨髓總單核細胞和Ly6Clow/?單核細胞比例升高，Ly6Chi/+單核細胞比例下降（P<0.05），血液中總單核細胞和Ly6Chi/+單核細胞比例下降，Ly6Clow/?單核細胞比例升高（P<0.01）；bFGF組骨髓和血液總單核細胞、Ly6Clow/?單核細胞和Ly6Chi/+單核細胞比例與模型組相比差異無統計學意義（P>0.05），見圖7。

討 論

慢性皮膚潰瘍表現出創面持續炎癥狀態，肉芽組織新生和表皮細胞爬行困難，創面難以愈合。在創面愈合的增殖期和重塑期，因機體高血糖等因素導致創面組織中大量的M1促炎型巨噬細胞難以向M2型極化，分泌大量的炎癥細胞因子，同時血液中Ly6Chi/+促炎型單核細胞被大量募集到局部組織，分化為吞噬能力較強的M1型巨噬細胞，吸引更多的炎癥細胞，導致創面愈合機制難以啟動［4］。回陽生肌湯是回陽生肌法的內服代表方劑，為臨床上治療慢性皮膚潰瘍的經驗方，可加速慢性皮膚潰瘍“陰證”創面愈合，但其作用機制尚不清楚。本研究證明回陽生肌湯能促進db/db糖尿病小鼠慢性皮膚潰瘍創面愈合，通過抑制Ly6Chi/+促炎型單核細胞動員和募集，促進Ly6Clow/?抗炎型單核細胞動員和募集，減少創面中血液來源的M1型巨噬細胞數量，增加M2型巨噬細胞數量，促進創面血管新生和細胞外基質形成。

Figure 4.Huiyang-Shengji decoction（HYSJD）promotes the regeneration of granulation tissue in diabetic mice（HE staining of wound tissue on the 7th day，scale bar=2 mm）.圖4 回陽生肌湯促進糖尿病小鼠創面肉芽組織新生

隨著生活水平不斷提高，慢性皮膚潰瘍病因復雜化，其中糖尿病為主要致病因素。患者多因糖代謝紊亂，機體糖基化終末產物富集，血管、神經功能受損，導致破潰皮膚組織糖元利用度下降，細胞衰老壞死，局部生長因子釋放減少。臨床多表現為創面平塌或下陷、滲液清稀，肉芽蒼白水腫。因陰虛熱盛，耗氣傷陰，導致神疲乏力、倦怠等全身癥狀，長期拖延失治或誤治，創面干枯黧黑，全身腰膝酸軟，中醫診斷為“氣血不足，脾腎陽虛，腎精虛衰”，屬瘡瘍“陰證”范疇。回陽生肌湯是北京中醫醫院名老中醫趙炳南、王玉章和呂培文治療瘍瘡“陰證”的臨床經驗方劑，具有益氣養血、溫補脾陽、補腎填精的功效［8］。

回陽生肌湯由生黃芪、炒白術、蒼術、茯苓、肉桂、附子、鹿角霜、木瓜、白芥子、熟地、當歸和北沙參組成。君藥附子、肉桂，補腎溫陽；臣藥鹿角霜、黃芪、白術、茯苓、熟地、當歸、北沙參，益氣養血、溫補腎陽；佐使藥木瓜、蒼術、白芥子，健脾除濕，共奏益氣養血、健脾補腎、溫陽散寒之效。腎為先天之本，脾為后天之本、氣血生化之源，因此調補脾腎，滋補腎精腎陽，氣血生化有源，使創面氣血來源充足，陽氣得以溫煦，改善創面微環境。回陽生肌湯治療后創面由晦暗變鮮活，膿液由清晰變濃稠，肉芽組織蒼白變紅潤，表現出一派由“陰證”轉“陽證”之象，創面逐漸愈合［9-10］。同時回陽生肌湯主要成分毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花素等已被大量研究。毛蕊異黃酮抑制Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）等信號通路，抑制氧化應激和炎癥反應，發揮抗炎、抗腫瘤、神經保護、維持上皮屏障等作用［11-13］。毛蕊異黃酮苷可保護缺血再灌注損傷，預防氧化應激［14-16］。刺芒柄花素為重要的抗癌靶標分子，改善高糖誘導的內皮損害，保護2型糖尿病的腎臟損傷［17-19］。

Figure 5.Huiyang-Shengji decoction（HYSJD）decreased the positive rate of M1 macrophages and increased the positive rate of M2 macrophages in the wound of diabetic mice.A and B：representative images of multiple immunofluorescence staining to identify different phenotypes of macrophages（scale bar=500μm in A；scale bar=200 nm in B）；C：the proportion of M2（a+c）and M1 macrophages in total macrophages in mouse wound tissue at 7 d.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs model group.圖5 回陽生肌湯降低糖尿病小鼠創面中M 1型巨噬細胞陽性率，升高M 2型陽性率

在本實驗中，db/db糖尿病小鼠為4號染色體的瘦素受體（leptin）基因缺陷導致的自發性2型糖尿病型小鼠。與db/m小鼠相比，db/db小鼠表現出高血糖，貪食、多飲、多尿，大便溏稀腥臭，蜷縮少動［20］，將背部進行6 mm直徑的全層皮膚切除術，形成經典的慢性皮膚潰瘍模型［21］。db/db小鼠皮膚創面清冷，滲液清稀，創面愈合遲緩。回陽生肌湯治療后顯著提高創面愈合率，創面顏色鮮活，滲液濃稠，肉芽組織紅潤，創面表現出由陰轉陽的趨勢。bFGF為堿性成纖維細胞生長因子，對創面中成纖維細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞等都具有促增殖作用，是臨床上常用的細胞生長因子藥物，臨床應用廣泛，為本實驗的陽性對照藥物［22-23］。與bFGF組相比，回陽生肌湯創面愈合率無統計學差異，說明回陽生肌湯是具有臨床推廣價值的藥物。

Figure 6.Huiyang-Shengji decoction（HYSJD）attenuated wound inflammation in diabetic mice.Mean±SD.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs model group.圖6 回陽生肌湯減輕糖尿病小鼠創面炎癥

與急性傷口相比，慢性皮膚潰瘍傷口顯示出巨噬細胞的數量和表型發生變化。在慢性傷口邊緣，80%的細胞是M1型巨噬細胞，且表現出向M2型極化障礙，是傷口慢性不愈合的重要機制［24］。糖尿病小鼠傷口模型顯示，在晚期糖基化終產物等物質的影響下，M2型巨噬細胞數量的減少導致調節修復增殖階段的轉化生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）和血管內皮生長因子（vascular endo‐thelial growth factor，VEGF）水平降低，傷口中聚集高水平的促炎細胞因子和介質，如TNF-α、IL-1β、IL-6和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）等，導致不愈合表型［25］。M2型又可分為M2a、M2b、M2c和M2d四種亞型，其中M2a型和M2c型在細胞外基質沉積和血管新生中發揮主要作用［26-28］。在創面中使用鐵螯合劑去鐵氧胺治療鐵負荷小鼠，可減少創面巨噬細胞向M1型極化，促進傷口愈合［29］。本實驗對第7天創面皮膚中不同表型巨噬細胞進行定量分析，回陽生肌湯治療后，創面中M1型巨噬細胞數量顯著下降，M2（M2a和M2c）型數量增多，MCP-1、IL-1α、IL-1β、TNF-α、TNF-RII和IFNγ表達水平顯著降低，說明回陽生肌湯治療后的創面中M2型巨噬細胞數量增多，創面炎癥減輕，肉芽組織新生。bFGF組創面中M2型巨噬細胞數量增多，但創面中與M1型巨噬細胞相關的IFN-γ、TNF-α、MCP-1等炎癥因子的表達水平仍升高，說明bFGF作為一種生長因子，可能通過級聯反應促進轉化生長因子等其他作用機制發揮作用，間接作用于巨噬細胞［30］。因此本實驗結果說明回陽生肌湯能調節創面中M1/M2型巨噬細胞平衡，促進M2型巨噬細胞數量增多，創面炎癥減輕，加速愈合。

創面中的巨噬細胞主要來源于血液中的單核細胞。通常Ly6Chi/+促炎型單核細胞募集到局部組織分化為M1型巨噬細胞；Ly6Clow/?抗炎型單核細胞募集到創面分化為M2型巨噬細胞。在創面愈合的不同時期，存在不同步趨化，且兩者可相互轉化［31］。創面免疫細胞分泌的趨化因子影響單核細胞的募集，參與單核細胞通過血管內皮細胞的遷移和活化［32-33］。在糖尿病小鼠創面中，趨化因子MCP-1促使發育不成熟的Ly6Chi/+單核細胞二次募集。在缺乏MCP-1、MCP-3或C-C趨化因子受體2（C-C chemokine recep‐tor 2，CCR2）介導信號的小鼠骨髓中，主要保留Ly6Chi/+單核細胞［34］。骨髓間充質干細胞在血管竇附近釋放MCP-1，將Ly6Chi/+單核細胞吸引到內皮近腔面［35］，說明MCP-1信號介導Ly6Chi/+單核細胞從骨髓向血液中動員和向創面募集，導致M1型巨噬細胞數量增多，炎癥期延長。同時基質細胞衍生因子1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）釋放水凝膠可局部吸Ly6Clow/?抗炎型單核細胞，促進小鼠背部皮膚微血管網的生成和重塑［36-37］。回陽生肌湯治療后MCP-1分泌水平下降，我們使用流式細胞術檢測骨髓及血液中Ly6Chi/+和Ly6Clow/?單核細胞，結果顯示Ly6Chi/+單核細胞從骨髓向血液中動員和向組織募集減少，Ly6Clow/?單核細胞動員和募集數量增多，這可能是創面中血液來源的M1型巨噬細胞數量減少，M2型巨噬細胞數量增多的重要原因之一。

Figure 7.Huiyang-Shengji decoction（HYSJD）inhibited the mobilization and recruitment of Ly6Chi/+monocytes.A：schematic dia‐gram and statistical graph of the proportion of total，Ly6Chi/+and Ly6Clow/?monocytes in mouse bone marrow；B：schematic diagram and statistical graph of the proportion of total，Ly6Chi/+and Ly6Clow/?monocytes in mouse blood.Mean±SD.n=5.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05，##P<0.01 vs model group.圖7 回陽生肌湯抑制Ly6Chi/+巨噬細胞動員和募集

綜上所述，本研究證實回陽生肌湯能夠提高糖尿病小鼠皮膚創面愈合率，促進肉芽組織新生，減少創面中血液來源M1型巨噬細胞數量，增加M2型巨噬細胞數量，降低創面炎癥因子水平，其作用可能是通過抑制創面趨化因子MCP-1釋放，抑制Ly6Chi/+單核細胞的動員和募集，促進Ly6Clow/?單核細胞的動員和募集，從而使創面炎癥水平下降，加速愈合。但回陽生肌湯是通過何種機制促進Ly6Clow/?單核細胞動員和募集的，有待我們進一步探索。這一基礎研究為回陽生肌湯的臨床應用提供了科學依據，并為進一步在多種動物模型上研究回陽生肌湯的作用提供了證據和方向。但回陽生肌湯能否直接作用于巨噬細胞，促進M1型向M2型極化，有待我們進一步體外驗證。