順鉑通過ROS介導ClC-3上調誘導鼻咽癌細胞凋亡*

徐培聲，林嘉偉，俞美聲，譚秋嬋，朱林燕，彭 爽，陳麗新，王 亮 王立偉△

（暨南大學基礎與公共衛生學院1生理學系，3藥理學系，4病理生理學系，廣東廣州510632；2佛山市第一人民醫院，廣東佛山528000；5暨南大學第一附屬醫院腫瘤科，廣東廣州510632；6廣州衛生職業技術學院生理學系，廣東廣州510180）

鼻咽癌是一種發生于鼻咽腔頂部和側壁的上皮癌，集中發病于我國廣東、廣西等南部地區。使用順鉑（cisplatin，Cisp）化療的同時進行放療是常用的治療晚期鼻咽癌手段之一［1］。然而順鉑的作用機制尚不十分明確。本課題組前期研究發現，順鉑可激活低分化鼻咽癌CNE-2Z細胞氯電流［2］，ClC-3氯通道參與了雙氫青蒿素和唑來膦酸所誘導的鼻咽癌細胞凋亡［3-4］。文獻報道，活性氧（reactive oxygen species，ROS）對氯通道發揮其生物學功能特性具有一定作用［5］。而ClC-3氯通道和ROS在順鉑誘導的鼻咽癌細胞凋亡中的作用及機制，目前還不清楚。本文主要探討ClC-3氯通道是否參與順鉑誘導鼻咽癌CNE-2Z細胞凋亡，以及ROS在其中所發揮的作用，為探討氯離子通道在抗腫瘤中的作用提供更多的理論和實驗依據。

材料和方法

1 細胞株

本實驗所用的人低分化鼻咽癌細胞株CNE-2Z由廣東醫科大學唐慰萍教授惠贈。

2 主要試劑

5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide，MTT］、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、4，4'-二異硫氰酸基-2，2'-二苯乙烯磺酸二鈉（4，4'-Diisothiothiocy‐anatostilbene-2，2'-disulfonic acid disodium salt hy‐drate，DIDS）與N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cys‐teine，L-NAC）購于Sigma；順鉑購自江蘇豪森藥業股份有限公司，使用前用細胞培養液稀釋至所需濃度；RPMI-1640培養基與質粒轉染專用培養液購于Gib‐co；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購于Biologi‐cal Industries；活性氧檢測試劑盒與RIPA細胞裂解液購于碧云天公司；ClC-3抗體購于Cell Signaling Technology；GAPDH抗體購于Proteintech；山羊抗兔辣根過氧化物酶IgG（H+L）購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；siRNA購于吉瑪；Annexin VFITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒購于凱基生物。DIDS溶解于DMSO中，配制成50 mmol/L的儲存液，實驗時稀釋成100μmol/L的工作溶液。L-NAC用PBS溶解，配制成100 mmol/L的儲存液，實驗時稀釋成1 mmol/L的工作溶液。

3 主要方法

3.1 細胞培養 用于CNE-2Z細胞培養的RPMI-1640完全培養基內含有10%FBS、1×105U/L的青霉素以及100 mg/L的鏈霉素。細胞在37℃、濕度飽和的5%CO2細胞孵育箱內培養生長。每48 h進行傳代。

3.2 MTT法檢測細胞活力 把處于生長對數期的CNE-2Z細胞以每孔約7×103接種于96孔板，設6個復孔。待其貼壁，更換含有不同濃度順鉑（0.625～160μmol/L）的完全培養基，37℃下分別培養24 h和48 h后，每孔加入15μL的MTT，37℃培育4 h。棄除培養基，每孔加入150μL的DMSO，振蕩孔板，37℃孵育10 min，以充分溶解結晶。在酶標儀上測定480 nm波長處吸光度（A）值，以空白組調零，對比對照組，得到實驗組細胞的存活率，用GraphPad Prism 8軟件計算順鉑24 h和48 h的IC50值。

3.3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率CNE-2Z細胞以每孔約1.5×105接種于6孔板，待其貼壁，更換為含5μmol/L和10μmol/L順鉑的完全培養基，37℃下分別培養24 h和48 h。對細胞進行消化收集處理后，PBS洗滌細胞2次，用低速冷凍離心機以2 000 r/min離心5 min，收集細胞。去除PBS，先加入200μL的Binding Buffer重新懸浮細胞，再分別加入2μL的Annexin V-FITC和PI混勻。室溫避光，讓其反應5～15 min后，在流式細胞儀上樣檢測凋亡。

3.4 細胞ROS檢測 消化收集細胞，用無血清的RPMI-1640培養基沖洗后，加入以1∶1 000稀釋熒光探針DCFH-DA的無血清培養基，37℃避光孵育30 min，重復清洗。用多功能微孔板檢測儀設置488 nm的激發波長，525 nm的發射波長進行DCF連續實時熒光強度檢測，每分鐘收集一個數據。另外，用ROS檢測試劑盒檢測ROS含量，各步驟按照生產廠家說明進行，在流式細胞儀進行ROS檢測。

3.5 轉染ClC-3 siRNA 細胞種板貼壁后，將轉染試劑放置常溫，使用前輕輕晃勻。用無血清和抗生素的RPMI-1640培養基稀釋轉染試劑Lipofectami‐neTM2000和待轉染的siRNA至合適體積，將二者混勻成轉染復合體，室溫靜置5 min。用無血清培養液洗孔板中的細胞2～3次，在每孔加入2 mL培養液，把siRNA和轉染試劑形成的轉染復合物均勻地加入6孔板內，每孔400μL，6 h后更換為含血清培養基，繼續培養48 h后完成轉染。除ClC-3 siRNA轉染組外，另外設置陰性對照（negative control，NC）siRNA組。ClC-3 siRNA正義鏈為5'-CAAUGGAUUUCCU‐GUCAUATT-3'，反義鏈為5'-UAUGACAGGAAAUC‐CAUUGTA-3'；NC siRNA正 義 鏈 為5'-UUCUCC‐GAACGUGUCACGUTT-3'，反 義 鏈 為5'-ACGUGA‐CACGUUCGGAGAATT-3'。

3.6 Western blot法檢測蛋白表達 收集CNE-2Z細胞，PBS洗凈后加入合適的RIPA細胞裂解液，4℃冰上裂解30 min，再用高速冷凍離心機以12 000 r/min離心15 min。提取上清的蛋白溶液，用BCA法進行蛋白定量。制備10%的SDS-PAG，加入樣品蛋白后，首先80 V電泳至Marker彼此分開，然后轉換成120 V。其次把蛋白電轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h。再以1∶800稀釋的ClC-3Ⅰ抗，4℃過夜孵育，TBST洗滌后，以1∶3 000稀釋的山羊抗兔辣根過氧化物酶IgG常溫孵育2 h。最后洗凈PVDF膜，利用凝膠成像系統顯影，采用Image-Pro Plus軟件進行圖像分析，測定灰度值。以GAPDH為內參照，計算相對比值。

4 統計學處理

統計學處理用SPSS 20.0統計軟件進行分析。每組實驗均重復3次以上，數據采用均數±標準差（mean±SD）表示。用單因素方差分析（one-way ANO‐VA）檢驗均數差異顯著性。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 氯通道阻斷劑抑制順鉑誘導的CNE-2Z細胞凋亡

如圖1A所示，順鉑抑制CNE-2Z細胞生長，隨著順鉑的濃度增加和作用時間的延長，細胞活力逐漸降低，24 h和48 h時的IC50值分別為11.76μmol/L和5.05μmol/L。凋亡實驗結果如圖1B所示，5μmol/L順鉑組24 h和48 h凋亡率分別為（16.49±2.37）%和（42.27±4.83）%；10μmol/L順鉑組24 h和48 h凋亡率分別為（44.68±4.80）%和（84.98±5.19）%。表明順鉑誘導CNE-2Z細胞的凋亡作用存在時間和濃度依賴性。

為了探討氯通道在順鉑誘導的鼻咽癌細胞凋亡中的作用，我們觀察了氯通道阻斷劑DIDS對順鉑誘導的凋亡的影響。結果顯示，氯通道阻斷劑DIDS（100μmol/L）可顯著抑制順鉑誘導的CNE-2Z細胞凋亡，如圖1C所示，DIDS+Cisp組24 h細胞凋亡率為（29.69±3.57）%，與Cisp組凋亡率（40.36±3.14）%相比，凋亡率顯著降低（P<0.05）。兩組細胞48 h的凋亡率分別為（86.93±5.85）%和（41.29±5.71）%，差異有統計學意義（P<0.01）。與對照（control，Ctrl）組相比，DIDS組的細胞凋亡率沒有明顯改變（P>0.05）。以上結果表明，氯通道阻斷劑可抑制順鉑誘導的細胞凋亡，提示氯通道在一定程度上參與了順鉑誘導CNE-2Z細胞的凋亡。

2 下調ClC-3蛋白表達可抑制順鉑誘導的CNE-2Z細胞凋亡

為進一步研究參與順鉑誘導細胞凋亡的氯通道類型，我們觀察了順鉑作用后ClC-3氯通道表達的變化。結果如圖2A所示，順鉑可促進ClC-3蛋白的表達，與對照組相比，差異有顯著性（P<0.05）。我們進一步用ClC-3 siRNA下調細胞ClC-3的表達，觀察細胞凋亡的變化。由圖2B可以看出，ClC-3 siRNA可顯著下調ClC-3表達（P<0.01）。與Cisp組相比，ClC-3 siRNA+Cisp組凋亡率下降，順鉑作用細胞24 h的時候凋亡抑制率為32%（P<0.01），見圖2C。結果提示ClC-3氯通道參與了順鉑誘導的細胞凋亡。

3順鉑誘導CNE-2Z細胞ROS升高和細胞凋亡

為了研究ROS在順鉑誘導CNE-2Z細胞凋亡中的作用，我們用多功能微孔板檢測儀實時檢測了順鉑對ROS的影響，結果如圖3A所示，順鉑作用后在很短暫時間內就誘導CNE-2Z細胞產生ROS，作用30 min左右時ROS比加藥前提高約65%（P<0.01），達到一個較穩定的水平。氯通道阻斷劑DIDS對順鉑誘導的ROS提高沒有影響。進一步的實驗證明，抗氧化劑L-NAC（1 mmol/L）幾乎完全抑制順鉑所致的ROS升高（圖3B），并且使細胞細胞凋亡率從（43.53±3.15）%明 顯 下 調 至（18.57±2.57）%（P<0.01），見圖3C。上述結果提示，順鉑通過刺激CNE-2Z細胞生成ROS而誘導細胞凋亡。

4 ROS、ClC-3與細胞凋亡

在上述結果基礎上，我們進一步探討ROS、ClC-3在順鉑誘導的細胞凋亡中的相關關系。實驗結果表明，用抗氧化劑L-NAC抑制細胞產生ROS后，順鉑誘導的ClC-3蛋白表達被抑制（圖4A）。10μmol/L順鉑作用細胞24 h后，利用流式細胞儀檢測各組細胞的ROS水平，結果顯示，ClC-3 siRNA+Cisp組的ROS水平與順鉑組相比無顯著性差異（P>0.05），ClC-3 siRNA組和無序siRNA組之間ROS水平也無顯著性差異（P>0.05），表明下調ClC-3蛋白表達水平不影響ROS水平，提示ROS在ClC-3的上游發揮作用。以上結果提示，ROS調控ClC-3介導的順鉑誘導的細胞凋亡。

討 論

Figure 1.Cisplatin-induced apoptosis of CNE-2Z cells was inhibited by chloride channel blockers（DIDS）.MTT assay was used to determine the viability of cells treated with cisplatin.A：viability curve after treatment with cisplatin for 24 h and 48 h；B：the apoptosis induced by cisplatin was detected by Annexin V-FITC/PI double staining assay；C：the inhibitory effects of the chloride channel blocker，DIDS（100μmol/L），on cisplatin-induced apoptosis for 24 h and 48 h.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05 vs Cisp group.圖1 氯通道阻斷劑DIDS抑制順鉑誘導的CNE-2Z細胞凋亡

細胞凋亡異常在腫瘤以及許多疾病的發生發展中起著重要的作用。多種抗腫瘤藥物通過誘導腫瘤細胞凋亡而起到抑制腫瘤生長的作用。凋亡誘導劑可激活細胞膜氯通道，伴隨水的外流而導致細胞發生凋亡性容積減小，促發細胞凋亡［6-8］。氯通道是機體體內最常見的陰離子通道，介導細胞膜內外氯離子及其他多種陰離子的流動，廣泛參與細胞運動、細胞凋亡、細胞周期、自噬以及細胞器酸化等多種細胞生理過程。我們前文報道，紫杉醇和阿霉素可能通過激活氯通道而發揮抗腫瘤作用［9-10］。順鉑是一種常用的化療藥物，順鉑可以激活氯電流，該電流對容積變化敏感［11］。氯通道的類型較多，參與順鉑抗腫瘤作用的氯通道類型及其作用機制目前尚不清楚，本文探討了ClC-3氯通道在順鉑誘導CNE-2Z細胞凋亡中的作用。

Figure 2.Inhibition of ClC-3 protein expression suppressed the apoptosis induced by cisplatin.A：the representative band of ClC-3 and control protein（GAPDH）after treatment with cisplatin for 24 h and the intensity ratio of ClC-3 band to the standard band GAPDH；B：ClC-3 expression after treatment with negative siRNA and ClC-3 siRNA；C：down regulating ClC-3 in‐hibited cisplatin-induced apoptosis.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs 0μmol/L group；△△P<0.01 vs Ctrl group；##P<0.01 vs Cisp group.圖2 抑制ClC-3蛋白表達可降低順鉑誘導的CNE-2Z細胞凋亡

本研究結果表明，順鉑時間和濃度依賴性抑制CNE-2Z細胞生長，誘導細胞凋亡，該作用可被氯通道阻斷劑所抑制，表明氯通道參與了順鉑誘導的細胞凋亡。氯通道有多種類型，包括囊性纖維化跨膜調節器（CFTR）、電壓門控氯通道（ClC）、細胞容積調節性氯通道（VRAC）以及配體門控性氯通道。ClC-3是ClC電壓門控氯通道家族的一員。ClC-3氯通道由CLCN3基因編碼［12］，廣泛分布在各種器官與細胞中［13-14］，尤其在腫瘤細胞中具有較高活性［15］。ClC-3在質膜、細胞核和細胞器上都有表達，在細胞的增殖、遷移和耐藥等中起重要作用［16-18］。本實驗室前期研究發現，ClC-3可能是紫杉醇和蟾蜍二烯羥酸等多種抗腫瘤藥物作用的靶點之一，ClC-3的過表達是胃癌患者預后不佳的生物標志，XRCC5調控ClC-3在胃癌中的表達和功能，ClC-3在胃癌中主要生物學功能是參與細胞增殖和細胞遷移，PI3K/Akt信號通路為其下游主要信號通路［19］。蟾蜍二烯羥酸內酯激活細胞ClC-3氯通道，同時抑制PIK3/Akt/mTOR，導致細胞的凋亡［20］。H2O2促進原來不易進入細胞的熒光染料進入細胞，而氯通道阻斷劑可阻抑細胞攝取熒光染料［7］。文獻報道，抑制ClC-3表達對順鉑誘導的人卵巢癌細胞順鉑耐藥株SKOV3/DDP細胞凋亡具有促進作用［21］，推測可能與該通道參與調節藥物跨細胞膜轉運，提高耐藥細胞內藥物濃度和細胞對藥物的敏感性有關。化療藥物紫杉醇可上調ClC-3蛋白的表達，參與細胞凋亡［9］。高糖在誘導海馬神經元凋亡的同時，ClC-3表達也上調［22］。ClC-3蛋白還參與CNE-2Z細胞的自噬［23］。本研究發現，順鉑促進CNE-2Z細胞ClC-3蛋白表達，ClC-3 siRNA下調細胞ClC-3的表達可使細胞凋亡率明顯下降，提示ClC-3可能是順鉑致凋亡作用的靶點之一。

Figure 3.The antioxidant L-NACsuppressed cisplatin-induced apoptosis.A：the levels of ROSunder different treatments.The level of ROSincreased after the stimulation with cisplatin.B：the antioxidant L-NACinhibited the Cisp-induced release of ROS.C：the inhibitory effect of L-NACon Cisp-induced apoptosis for 24 h.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs Ctrl group；##P<0.01 vs Cisp group.圖3 抗氧化劑L-NAC抑制順鉑誘導的細胞凋亡

順鉑誘導細胞凋亡的機制復雜，caspase途徑、p53、死亡結構域家族、Bcl家族和三磷酸鳥苷信號轉導等多條凋亡通路參與順鉑誘導的細胞凋亡。順鉑還可通過增加細胞胞內的氧化自由基提高其活性以及下調細胞中抗氧化酶類活性，從而對細胞造成氧化應激誘導細胞凋亡。本文結果顯示，無論用氯通道阻斷劑還是利用siRNA干擾ClC-3氯通道的表達，都只能部分抑制順鉑誘導的細胞凋亡效應，表明除了氯通道以外，還存在其他的作用靶點參與順鉑誘導的細胞凋亡。

Figure 4.Cisplatin-induced ClC-3 protein expression was inhibited by L-NAC.A：the ClC-3 protein expression under different treat‐ments；B：the ROSlevel detected by flow cytometry under the indicated conditions.After treatment with cisplatin，the ROSlevel in CNE-2Z cells was significantly increased but had little change in cells which transfected with CLC-3 siRNA.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs Cisp group；##P<0.01 vs Ctrl group；△△P<0.01 vs NCsiRNA group；▲▲P<0.01 vs ClC-3 siRNA group.圖4 順鉑誘導的ClC-3蛋白表達上調被L-NAC抑制

高濃度的活性氧會引起氧化應激反應并直接損傷細胞，觸發細胞發生凋亡。活性氧與氯通道有密切的關系，ROS在ClC-3內部二硫鍵的形成和半胱氨酸硫代陰離子的修飾中發揮了重要作用，對ClC-3的表達和功能至關重要［24］。H2O2激活氯通道，并誘導細胞凋亡，提示活性氧可能是調控氯通道開放的重要因素［7］。活性氧能激活VSOR氯通道，引起調節性細胞容積回縮［25］。口腔鱗狀細胞可以通過ROSAMPK通路而影響順鉑對細胞的自噬以及凋亡作用［26］，欖香烯能通過該途徑增強順鉑對膀胱癌細胞的凋亡作用［26］。唑來膦酸通過升高細胞內ROS含量，激活氯電流，誘導CNE-2Z細胞發生凋亡［4］。LNAC是一種有效的抗氧化劑，具有干擾自由基生成和清除自由基的功能。我們前文報道［23］，鼻咽癌CNE-2Z細胞在無血清培養液處理下，產生活性氧ROS，并上調ClC-3蛋白表達。本研究結果表明，順鉑促使CNE-2Z細胞ROS升高和ClC-3蛋白表達上調，抗氧化劑L-NAC非常有效地阻斷這些作用，使細胞凋亡率明顯下降。而下調ClC-3表達水平并不能改變ROS的水平，以上結果提示，ROS可能在ClC-3的上游發揮作用，順鉑通過提升CNE-2Z細胞ROS水平，上調ClC-3氯通道蛋白而誘導細胞凋亡。