魚膠原肽對面包酵母及冷凍面團的抗凍保護作用

劉海冬，劉偉，劉永樂，俞健，郭星辛，王發祥

(長沙理工大學 化學與食品工程學院，湖南省水生資源食品加工工程技術研究中心，湖南 長沙, 410114)

冷凍面團技術是20世紀50年代發展起來的面點新工藝，是運用冷凍原理與技術對面胚半成品進行冷凍處理并冷凍保藏一段時間，待用時解凍，再銜接后續加工流程生產出成品[1]；相對傳統的面點加工和銷售方式，冷凍面團相關產品具有安全、方便、利于標準化、適合連鎖生產等特點，在中央廚房模式和連鎖經營概念日益普及的背景下，是我國傳統發酵面制品工業化的必然趨勢。然而，由于在整形、醒發、烘烤(蒸制)流程的某個環節加入了冷凍貯藏工序，冷凍環節不可避免地會影響面團品質[2-3]。關于冷凍損害面團品質的機理，目前普遍認為是冰晶形成導致面團中酵母菌死亡、面筋網絡結構破壞、水分狀態改變等[4-6]。目前，添加合適的抗凍保護劑仍是改善面團冷凍損害的最有效途徑，因此，研究和開發高效抗凍劑具有重要的現實意義。

抗凍蛋白(肽)具有熱滯活性、修飾冰晶、抑制冰晶重結晶、保護細胞膜等特性[7-8]，近年來在提高酵母耐凍性能和改善冷凍面團品質方面的研究受到了廣泛關注[9]。如JIA等[10]從女貞葉中分離到一種熱穩定性冰結構蛋白，能降低酵母菌冷凍過程中的胞內冰晶形成和還原性物質釋放，從而提高酵母菌冷凍存活率；DING等[11]報道了大麥抗凍蛋白能改善面團的熱性能，限制水分的遷移，對冷凍面團具有很好的保護效果；GONG等[12]最近從絲膠蛋白水解物中篩選到一種絲膠肽，能顯著降低冷凍面團的游離水含量、提高酵母的存活率。然而，目前很多天然的抗凍蛋白(肽)或處在實驗室研究階段，或存在產量低、價格昂貴、熱穩定性差等問題，仍需要解決其面臨的產業化問題。本研究以商品化的魚鱗膠原肽為對象，研究其對冷凍面團酵母存活率和冷凍面團的品質指標的影響，為魚膠原肽在冷凍面團中的應用奠定基礎，也為冷凍面團工業生產化中抗凍劑的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚膠原肽(來自魚鱗，分子質量500～3 000 Da)，海南華研膠原科技有限公司；高筋小麥粉(蛋白質11.1 g/100g，脂肪1.5 g/100g，碳水化合物75.3 g/100g)，克明面業股份有限公司；高活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司；海藻糖(≥98%)，上海笛柏化學品技術有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養基，廣東環凱微生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PE9600 WT面包機，柏翠電器有限公司；UKOEO-F150醒發箱，珠海家寶德科技有限公司；YXD-Z204電熱烤箱，廣州三鼎金屬制品有限公司；UV 102PC紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌懸液的制備

稱取干酵母1.0 g，分散于100 mL無菌水中，置于恒溫搖床28 ℃、120 r/min活化30 min；量取9.0 mL，加入1.0 mL不同質量濃度(0、20、40、60、80 g/L)的魚膠原肽溶液和40 g/L海藻糖溶液(陽性對照)作為抗凍劑，混合均勻即為酵母菌懸液。

1.3.2 酵母菌存活率的測定

將上述酵母菌懸液進行0～6次凍融循環處理(-18 ℃冷凍18 h，4 ℃解凍6 h為1次凍融循環)，參考熊思佳等[13]的方法，分別測定懸液經0、2、4、6次凍融循環后的酵母菌存活率，根據存活率大小分析魚膠原肽對酵母菌的抗凍保護效果及其適合添加質量濃度。

1.3.3 冷凍面團的制備

空白組面團配方：面粉200 g、去離子水100 g、白砂糖10 g、食鹽2 g、干酵母0.8 g；陽性對照組和實驗組面團分別以同樣質量的海藻糖溶液(40 g/L)和膠原肽溶液(60 g/L)替代去離子水。

按配方稱取面粉、白砂糖、食鹽、干酵母，混合均勻置于面包機中，加入水或抗凍劑溶液，自動和面15 min，面團分成若干個30 g的小面團，放入面包模具中壓實，分別進行0～6次凍融循環(-18 ℃冷凍18 h，4 ℃解凍6 h)后測定相關指標。

1.3.4 魚膠原肽對冷凍面團相對發酵力的影響

參照GB/T 20886—2007《食品加工用酵母》[14]，采用排水法測定30 g冷凍面團發酵180 min產生的CO2，以CO2體積表示面團中酵母菌的發酵力，其與相應面團0次凍融循環時發酵力的比值表示為相對發酵力。

1.3.5 魚膠原肽對冷凍面團烘焙特性的影響

面團凍融處理0～6次循環，置于醒發箱中醒發4 h，參照郭星辛等[15]的方法放入預熱的烤箱烘烤15 min，室溫冷卻30 min后測定面包比容和質構。其中，面包比容參照GB/T 20981—2007《面包》[16]采用排菜籽法測定；面包彈性采用質構儀測定[15]。

1.3.6 冷凍面團中濕面筋含量的測定

濕面筋含量參考GB/T 5506.1—2008《小麥和小麥粉 面筋含量》[17]采用手洗法測定。取30 g冷凍面團于200 mL的去離子水中，先靜置20 min后用手揉搓面團，期間不斷的更換去離子水直至洗滌面團的水無淀粉檢出，排水后稱重，得濕面筋質量m，濕面筋含量按公式(1)計算：

(1)

1.3.7 面筋中巰基含量的測定

將1.3.6中得到的濕面筋，置于-70 ℃預凍過夜，凍干后以粉碎機打碎，過120目篩。粉末參照WANG等[18]的方法分析其活性巰基含量。

1.3.8 數據處理與統計分析

2 結果與分析

2.1 魚膠原肽對酵母菌抗凍保護作用

魚膠原肽對酵母菌懸液凍融過程中酵母菌存活率的影響如圖1所示。可見，隨著凍融次數的增加，酵母菌存活率逐漸下降，6次凍融循環后，魚膠原肽組酵母菌存活率為39%，與陽性對照海藻糖組(40%)相當，顯著高于(P<0.05)空白組(9%)。郭星辛等[15]將魚膠原肽作為抗凍劑應用于冷凍面團中，發現6次凍融循環后面團中酵母菌存活率為61%，與海藻糖組(61%)相當。可見，上述結果表明魚膠原肽對懸液和面團中的酵母菌細胞均具有較好的抗凍保護作用。大量研究已證實來自魚皮、魚鱗等的膠原肽能通過羥基及疏水相互作用與冰晶表面結合，減少冰晶的生長，防止細胞膜蛋白變性，從而顯示出良好的微生物抗凍保護活性，而且其分子質量主要分布在<3 000 Da 的范圍內[19-21]，這與本研究的結果相符。

圖1 魚膠原肽對酵母菌凍融處理后存活率的影響Fig.1 Effect of fish collagen peptides on the survival rate of yeast with freeze-thaw treatment 注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 魚膠原肽質量濃度對酵母菌凍融存活率的影響

將不同質量濃度的魚膠原肽加入酵母菌懸液中，凍融處理后酵母菌的存活率見圖2。可見，隨著凍融循環次數增加，酵母菌存活率均呈現下降的趨勢，但添加魚膠原肽能明顯提高懸液中酵母菌存活率，其中質量濃度為60 g/L時酵母菌存活率最高(47%)，顯著高于空白(0 g/L)組(9%)。此外，魚膠原肽質量濃度為80 g/L時酵母菌存活率反而較60 g/L時有所降低，可能是因為其質量濃度過大使酵母菌處于高滲透壓環境中，導致部分細胞失水過多死亡[22]。

圖2 魚膠原肽質量濃度對酵母菌凍融處理后存活率的影響Fig.2 Effect of concentration of fish collagen peptides on the survival rate of yeast with freeze-thaw treatment

2.3 魚膠原肽對冷凍面團相對發酵力的影響

將魚膠原肽作為抗凍劑加入冷凍面團，分析其對面團凍融循環處理后酵母菌發酵力的影響，結果見圖3。隨著凍融循環次數增加，面團中酵母菌的相對發酵力呈下降趨勢；6次凍融循環后，魚膠原肽組相對發酵力為0.47，與海藻糖組(0.49)差異不大(P>0.05)；而空白組僅為0.27，顯著低于另外2組(P<0.05)。這與圖1中結果一致，表明添加膠原肽提高了冷凍面團中酵母菌的存活率，從而較好地保留了其發酵力，這與GONG等[12]和郭星辛等[15]的結果一致。

圖3 魚膠原肽對面團凍融處理后相對發酵力的影響Fig.3 Effect of fish collagen peptides on the relative fermentability of dough with freeze-thaw treatment

2.4 魚膠原肽對冷凍面團烘焙特性的影響

魚膠原肽對冷凍面團面包比容和彈性的影響如圖4所示，可見，隨凍融循環次數的增加，面包比容和彈性逐漸下降。0次凍融循環時，魚膠原肽組面包的比容為3.3 mL/g，與海藻糖組(3.2 mL/g)相當，高于空白組(2.8 mL/g)；6次凍融循環后，魚膠原肽組和海藻糖組面包的比容分別降低了16.1%、13.3%，降幅明顯低于空白組(18.4%)。面包彈性與比容的變化趨勢基本一致，空白組彈性下降最快，6次凍融循環后下降了38.5%，顯著高于(P<0.05)魚膠原肽組(13.8%)和海藻糖組(9.2%)，這與李靈等[23]的研究結果一致。因此，添加魚膠原肽有利于維持冷凍面團的焙烤特性，這可能是因為魚膠原肽具有修飾冰晶及抑制重結晶的作用，使面團冷凍過程中生成的冰晶體積小且比較均勻[24]，減緩了凍融循環對面筋結構的破壞。

2.5 魚膠原肽對冷凍面團面筋含量的影響

凍融循環次數處理對冷凍面團中濕面筋含量的影響如圖5所示。可見，隨著凍融次數的增加，面團濕面筋的含量逐漸下降，可能是因為冰晶形成和重結晶導致了面筋蛋白分子質量下降、面筋網絡結構機械損傷[25]，從而導致了面筋蛋白分子溶解性的變化。凍融過程中，空白組的濕面筋含量下降幅度最大，6次凍融后，每100 g面團中濕面筋降低了17%，顯著高于(P<0.05)膠原肽組(12%)和海藻糖組(13%)，說明魚膠原肽能防止面團凍融過程中面筋蛋白變化，減緩面筋含量下降。孫麗潔等[21]發現魚膠原肽具有較強的親水性，能降低冷凍面團中可凍結水含量，減少冰晶的形成；而且，還能通過形成氫鍵使面團形成更致密的面筋網絡，從而限制水分流失，保護面筋結構[12,23]。

圖5 魚膠原肽對面團凍融處理后面筋含量的影響Fig.5 Effect of fish collagen peptides on the gluten content in frozen dough with freeze-thaw treatment

2.6 魚膠原肽對冷凍面團游離巰基含量的影響

巰基通常以二硫鍵的形式參與到面筋蛋白聚集行為中，維持面筋蛋白的結構和功能[26]。由圖6可知，隨著凍融次數的增加，面筋蛋白的游離巰基含量逐漸上升。這可能是由于凍融過程中的水分遷移和冰晶重結晶加速了面筋蛋白擠壓和分子間相互作用，導致其二硫鍵發生弱化和斷裂[27]；此外，酵母菌細胞在凍融過程中的機械損傷會釋放出還原性物質，也會破壞面筋結構中的二硫鍵[28]。6次凍融循環后，空白組面筋蛋白的游離巰基含量由5.25 μmol/g升至6.58 μmol/g，增加了25%；而魚膠原肽組和海藻糖組僅增加了8%和9%，顯著低于空白組(P<0.05)。這表明在凍融過程中魚膠原肽和海藻糖均對冷凍面團具有抗凍保護作用，可能其通過抑制冰晶形成和重結晶減弱了凍融過程中面筋和酵母菌細胞的損傷，從而抑制面筋蛋白的解聚和面筋蛋白中二硫鍵的斷裂[5]。

圖6 魚膠原肽對面團凍融處理后游離巰基含量的影響Fig.6 Effect of fish collagen peptides on the free sulfhydryl content in dough with freeze-thaw treatment

3 結論

魚膠原肽是一種潛在的冷凍面團抗凍劑，在凍融循環處理過程中對酵母菌細胞和冷凍面團面筋結構均具有良好的抗凍保護效果。結果表明，添加魚膠原肽能顯著提高酵母菌在凍融過程中的存活率，添加魚膠原肽冷凍面團的相對發酵力、面包比容和彈性均高于空白組。此外，添加魚膠原肽還可以抑制大分子蛋白的解聚和面筋蛋白中二硫鍵的斷裂。本研究采用的魚膠原肽是以魚鱗為原料經蛋白酶解技術獲得小分子肽類產品(分子質量范圍500～3 000 Da)，能提高冷凍酵母菌的存活率和發酵活力，減緩冷凍面團中面筋結構的破壞，在改良冷凍面團品質方面顯示出很好的應用前景，研究結果為促進國內冷凍面團技術的產業化和品質提升提供了有價值的參考。