茅莓根提取物的體外抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶抑制能力研究

林紫蘭，沙小梅，張志斌，夏其樂，孫蕊,4*，王振興

1(西南林業(yè)大學 林學院，云南 昆明，650224)2(江西師范大學 生命科學學院，江西 南昌，330022) 3(浙江省農業(yè)科學院 食品科學研究所，浙江 杭州，310021)4(西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室 (西南林業(yè)大學)，云南 昆明，650224)5(西南林業(yè)大學 生命科學學院，云南 昆明，650224)

茅莓(RubusparvifoliusL.)是薔薇科懸鉤子屬植物，又名三月泡、紅梅消，其分布廣泛，資源豐富，頗具觀賞價值。茅莓的果實可以食用，酸甜多汁，富含VC、總酸及蛋白質等，具有較高的開發(fā)價值，常被用于釀酒、制醋及飲料中[1-2]。如翟明昌等[3]以茅莓、枸杞為原料制作了一款酸甜可口、營養(yǎng)價值高的保健功能果汁飲料。另外，茅莓還可入藥，根據(jù)《中藥大辭典》[4]中記載，茅莓全草可當藥物使用，具有清熱涼血、利尿消腫等多種功能功效。

茅莓根是茅莓的根部，是一種民間傳統(tǒng)的中藥材。傳統(tǒng)藥理學顯示，茅莓根提取物及其萃取組分具有較好的抗炎[5]和抗氧化[6]作用；化學成分研究表明，茅莓根的主要藥用成分為黃酮類化合物、三萜及三萜皂苷等。如MEI等[7]采用硅膠柱層析法和核磁共振波譜對茅莓根進行提取和鑒定，從中分離得到神經酰胺、蒽醌類化合物和三萜類化合物；CAO等[8]通過小鼠實驗發(fā)現(xiàn)茅莓總皂苷可以抑制惡性黑色素瘤細胞的侵襲、遷移和轉移，具有一定的抗腫瘤作用。目前，關于茅莓根的研究主要集中在其化學成分上，對茅莓根的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶酶抑制作用的研究較少。現(xiàn)代醫(yī)學主要是通過抑制體內的α-葡萄糖苷酶活性和乙酰膽堿酯酶活性來分別治療糖尿病和阿爾茨海默癥(Alzheimer′s disease,AD)，而研究表明，AD、糖尿病等疾病的發(fā)生可能與人體內自由基氧化應激反應有一定的相關性[9]。因此，研究茅莓根的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶酶抑制作用，可為預防糖尿病和老年癡呆提供一定的參考價值。

為了進一步挖掘茅莓根的食用和藥用價值，本文以茅莓根的甲醇提取物為研究對象，分析其總酚、總黃酮含量，并測定其體外抗氧化活性和對α-葡萄糖苷酶以及乙酰膽堿酯酶的抑制能力，來評價其抗氧化、降血糖和防老年癡呆的潛力，可為茅莓根資源的高效利用和進一步開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

供試材料于2018年購自安徽毫州，經西南林業(yè)大學植物學教研室戚建華副教授鑒定為茅莓的根部。

1.1.2 主要試劑

α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖、加蘭他敏(galanthamine，GLTM)、4-甲基傘形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside，4-MUG)、電鰻乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)、碘化硫代乙酰膽堿(acetylthiocholineiodide，ATCI)、5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5，5-dithiobis(2-nitrobenzoicacid)，DTNB]，Sigma-Aldrich公司；奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)、VC、ABTS、DPPH、2，4，6-三吡啶基三嗪[2，4，6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ]、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2，6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT)，Solarbio公司；過硫酸鉀、甲醇、H2O2、FeSO4、FeCl3、NaOH、CuSO4、K2SO4、濃硫酸、鹽酸等均為國產分析純。

1.1.3 儀器與設備

SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；TGL-10C高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；U410-86超低溫冰箱，艾本德生物儀器有限公司；SYNERGY H1多功能酶標儀，美國BIOTEK公司；YB-250A高速多功能粉碎機，永康市速鋒工貿有限公司；SG5200HDT型超聲波清洗器，上海冠特超聲儀器有限公司。

1.2 樣品的制備

曬干的茅莓根經粉碎后過40目篩，取1 g茅莓根粉末，按照料液比1∶20(g∶mL)向粉末中加入體積分數(shù)為70%的甲醇溶液，在超聲波為300 W、溫度為50 ℃的條件下提取60 min。將提取物進行抽濾，濾渣再重新提取抽濾1次，合并2次濾液，在50 ℃下真空濃縮，用體積分數(shù)為70%的甲醇溶液定容至10 mL，制得茅莓根粗提物(RubusparvifoliusL.root extract，RRE)[10]。

1.3 有效成分及體外抗氧化活性的測定

1.3.1 總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu法測定總酚含量[11]。取20 μL 樣品溶液于96孔酶標板，加入20 μL 0.5 mol/L的福林酚溶液，混合5 min后加入160 μL 75 mg/mL的Na2CO3溶液，避光反應25 min后于765 nm下測定吸光值，以等體積的蒸餾水代替Na2CO3溶液作為對照組。配制質量濃度分別為10、20、40、60、80和100 μg/mL 的沒食子酸溶液，在相同條件下測定吸光值，并以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標來繪制標準曲線。其回歸方程為y=0.004 8x+0.019 5(R2=0.997 3)，可根據(jù)沒食子酸標準曲線計算RRE中總酚含量，結果以mg GAE/g表示。

1.3.2 總黃酮含量測定

參照吳昆明等[12]的方法測定樣品中的總黃酮含量。取40 μL樣品溶液于96孔酶標板，加入20 μL 30 mg/mL的Na2NO2溶液，在室溫下放置反應6 min后加入20 μL 60 mg/mL的Al(NO3)3溶液，接著室溫下反應6 min后再加入140 μL 40 mg/mL的NaOH溶液和60 μL體積分數(shù)為70%的甲醇溶液，靜置反應15 min后于510 nm下測定吸光值，以等量體積分數(shù)為70%的甲醇溶液分別代替Na2NO2溶液和Al(NO3)3溶液作為對照組。配制質量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g/L的蘆丁溶液，在相同條件下測定吸光值，并以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標來繪制標準曲線。其回歸方程為y=1.003 2x+0.011 2(R2=0.996 9)，可根據(jù)蘆丁標準曲線計算RRE中總黃酮含量，結果以mg Rutin/g表示。

1.3.3 DPPH自由基清除能力

取100 μL樣品溶液于96孔酶標板，加入100 μL DPPH溶液充分混合，避光反應30 min后在517 nm處測定其吸光值(As)，以體積分數(shù)為70%的甲醇溶液代替樣品溶液進行反應的吸光值為Ac，以體積分數(shù)為70%的甲醇溶液代替DPPH溶液進行反應的吸光值為Ab。以VC和BHT為陽性對照，并按公式(1)計算樣品的DPPH自由基清除率[11]：

(1)

以不同質量濃度(0～0.025 g/L)的Trolox的甲醇溶液作為標準品，以Trolox的質量濃度為橫坐標，DPPH自由基清除率為縱坐標作標準曲線，其回歸方程為y=4.554 4x-1.276 1(R2=0.993 0)。利用標準曲線計算樣品的Trolox當量，該數(shù)值代表RRE的DPPH自由基清除能力。

1.3.4 ABTS陽離子自由基清除能力

取50 μL樣品溶液于96孔酶標板，加入200 μL ABTS溶液充分混合，在室溫下避光反應6 min后在734 nm處測定其吸光值(As)，以體積分數(shù)為70%的甲醇溶液代替樣品溶液進行反應的吸光值為Ac，以體積分數(shù)為70%的甲醇溶液代替ABTS溶液進行反應的吸光值為Ab，以VC和BHT為陽性對照，并按公式(2)計算樣品的ABTS陽離子自由基清除率[11]：

(2)

以不同質量濃度(0～0.05 g/L)的Trolox的甲醇溶液作為標準品，以Trolox溶液的質量濃度為橫坐標，ABTS陽離子自由基清除率為縱坐標作標準曲線，其回歸方程為y=1.172 6x+2.247 0(R2=0.996 2)。利用標準曲線計算樣品的Trolox當量，該數(shù)值代表RRE的ABTS陽離子自由基清除能力。

1.3.5 超氧陰離子自由基清除能力

參考陳青青等[13]的方法略作修改，采用鄰苯三酚自氧化法測定超氧陰離子自由基清除能力。取20 μL樣品溶液于96孔酶標板，加入240 μL Tris-HCl緩沖液，在25 ℃溫育10 min。之后再加入20 μL 鄰苯三酚溶液，混合振蕩10 s，每隔1 min在325 nm下測定吸光值(As)，共測定5 min。以60 mmol/L Tris-HCl緩沖液溶液代替樣品溶液進行反應測定吸光值為Ac，以50 mmol/L Tris-HCl緩沖液代替鄰苯三酚溶液進行反應測定吸光值為Ab。以VC和BHT為陽性對照，并按公式(3)計算超氧陰離子自由基清除率：

(3)

以不同質量濃度(0～500 g/L)的Trolox的甲醇溶液為標準品，以Trolox溶液的質量濃度為橫坐標，超氧陰離子自由基清除能力為縱坐標作標準曲線，其回歸方程為y=0.126 4x-1.384 6(R2=0.994 5)。利用標準曲線計算樣品的Trolox當量，該數(shù)值代表樣品的超氧陰離子自由基清除能力。

1.3.6 鐵還原能力

參考劉江等[14]的方法略作修改，取30 μL樣品溶液于96孔酶標板，加入240 μL FRAP溶液(由300 mmol/L pH 3.6的醋酸鈉緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3組成)充分混合，在37 ℃避光反應10 min后在593 nm處測定吸光值(As)，以體積分數(shù)70%的甲醇溶液代替樣品溶液進行反應測定吸光值為Ac，以體積分數(shù)為70%的甲醇溶液代替FRAP溶液進行反應測定吸光值為Ab，以VC和BHT為陽性對照，并按公式(4)計算樣品的鐵還原能力：

(4)

以不同質量濃度(0～0.1 g/L)的FeSO4溶液作為標準品，以FeSO4溶液的質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標作標準曲線，其回歸方程為y=0.004 7x+0.059 3(R2=0.993 1)。利用標準曲線計算樣品中的FeSO4當量，該數(shù)值代表RRE的鐵還原能力。

1.4 α-葡萄糖苷酶活性抑制能力

參考LIAO等[15]的方法略作修改，取50 μL樣品溶液于96孔酶標板，加入20 μL α-葡萄糖苷酶溶液和50 μL 4-MUG充分混勻，37 ℃避光反應20 min后加入100 μL 甘氨酸鈉溶液并振蕩30 s終止反應，采用熒光分光光度計測定其在激發(fā)波長355 nm，發(fā)射波長460 nm處的熒光強度，以阿卡波糖為陽性對照，結果以抑制率表示，采用Origin軟件計算抑制率達到50%所需要樣品的半抑制質量濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，其中，IC50值越小，則代表α-葡萄糖苷酶活性抑制能力越高。按照公式(5)計算RRE中的α-葡萄糖苷酶抑制率：

(5)

式中：As是樣品的熒光值；Ac是以樣品溶劑代替樣品的反應體系的熒光值(控制組)；Ab是以磷酸鉀緩沖液代替酶液的反應體系的熒光值(空白組)。

1.5 乙酰膽堿酯酶活性抑制能力

參考MALAR等[16]的方法略作調整，取50 μL樣品溶液于96孔酶標板，加入90 μL ATCI溶液和DTNB溶液的混合液于30 ℃下溫育10 min，加入20 μL乙酰膽堿酯酶溶液充分混勻后，再加入50 μL磷酸鈉緩沖液振蕩10 s終止反應。每隔1 min在405 nm下測定1次吸光值，共測5次，每次測定前振蕩10 s，以加蘭他敏為對照，結果以抑制率表示，采用Origin軟件計算樣品的IC50值，其中，IC50值越小，則代表乙酰膽堿酯酶活性抑制能力越高。根據(jù)公式(6)計算RRE中的乙酰膽堿酯酶抑制率：

(6)

式中：As是樣品的吸光值；Ac是以樣品溶劑代替樣品的反應體系的吸光值(控制組)；Ab是以磷酸鉀緩沖液代替酶液的反應體系的吸光值(空白組)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復3次以上，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示。采用Origin 8.6軟件分析和作圖，SPSS 22.0軟件進行顯著性分析，P<0.05認為樣品間具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 總酚、總黃酮含量

酚類物質是植物次生代謝的產物，可有效清除人體內過量的自由基，延緩人體衰老，降低慢性疾病發(fā)生。近年來，天然植物多酚以通過清除過多的自由基來保護人類免受疾病威脅，已經成為安全、有效抗氧化劑的新來源[17]。根據(jù)沒食子酸標準曲線計算出RRE的總酚含量為(446.392±51.707) mg GAE/g，約是其同屬植物華東覆盆子嫩葉的6.4倍[13]，甘扎嘎日果的7.1倍[18]；天然來源的黃酮類化合物具有顯著的生物活性，對人體具有抗氧化、抗突變、抗癌和保護血管等功效[19]。根據(jù)蘆丁標準曲線計算出RRE的總黃酮含量為(638.337±124.537) mg Rutin/g，約是同屬植物山莓莖皮的22.2倍[20]，華東覆盆子老葉的7.3倍[13]。結果表明，RRE中含有豐富的酚類物質和黃酮類物質，可以作為一種新型高抗氧化膳食補充劑。

2.2 體外抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH是一種穩(wěn)定和良好定性的有機自由基，DPPH的醇溶液會釋放穩(wěn)定的自由基，在517 nm處有最大強度的吸收峰，故常用于表征樣品抗氧化活性的強弱程度[21]。由圖1可知，RRE的DPPH自由基清除能力[(871.878±89.338) mg Trolox/g]顯著高于VC[(287.707±8.424) mg Trolox/g]和BHT[(87.249±5.837) mg Trolox/g](P<0.05)，表明RRE對DPPH自由基具有較強的清除能力，呈現(xiàn)出較強的體外抗氧化能力。RRE的DPPH自由基清除能力強于同屬植物覆盆子的甲醇酸相、乙酸乙酯相提取物[22]，具有良好的抗氧化活性。結合表1的相關性分析可知，DPPH自由基清除能力與樣品中的總酚和黃酮含量都具有很高的相關性，可以通過對RRE的組分進行更深入的分析研究，為制作新型天然抗氧化劑提供新思路。

圖1 樣品與對照物的DPPH自由基清除能力Fig.1 The DPPH radical scavenging ability of sample and control 注：不同小寫字母代表顯著性差異(P<0.05)(下同)

表1 總酚、總黃酮與體外抗氧化實驗結果之間的相關性分析Table 1 The correlation analyses between total phenolics, total flavonoids and in vitro antioxidant experiment

2.2.2 ABTS陽離子自由基清除能力

ABTS經活性氧氧化會產生穩(wěn)定的陽離子自由基，呈現(xiàn)出藍綠色，并在波長734 nm處有最大吸收峰，如樣品溶液與ABTS陽離子自由基發(fā)生反應，使該反應體系褪色，則可說明該樣品中某些成分具有ABTS陽離子自由基清除活性，可以反映樣品的抗氧化能力[23]。由圖2可知，清除ABTS陽離子自由基的能力大小依次為VC[(9 583.422±1 376.617)mg Trolox/g]>BHT[(6 042.451±1 298.696)mg Trolox/g]>RRE[(1 177.854±87.024)mg Trolox/g]，雖然低于陽性對照VC和BHT(P<0.05)，但其清除能力仍強于同屬植物黑果懸鉤子的莖部[24]。與陽性對照相比，RRE的ABTS陽離子自由基清除能力的結果與DPPH自由基清除能力的結果有所差異，原因在于兩者的機理之間不同[23]，VC和BHT更有利于清除ABTS陽離子自由基。研究表明，植物中的酚類物質是清除ABTS陽離子自由基的主要活性成分[25]，結合表1的相關性分析，ABTS陽離子自由基清除能力與樣品中總酚含量之間具有很高的相關性，而RRE中酚類化合物含量豐富，說明RRE具有一定的ABTS陽離子自由基清除能力。

圖2 樣品與對照物的ABTS陽離子自由基清除能力Fig.2 The ABTS+ radical scavenging ability of sample and control

2.2.3 超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基可以誘導生物體內的氧化應激和脂質過氧化，當生物體內超氧陰離子自由基過量時，會破壞血腦屏障和使細胞死亡，增加腦出血的可能，嚴重地威脅人類健康[26]。所以超氧陰離子自由基清除能力的強弱是評價樣品抗氧化能力的一個重要指標。由圖3可知，超氧陰離子自由基清除能力大小依次為VC[(1 513.921±30.717) mg Trolox/g]>RRE[(419.928±54.146) mg Trolox/g]>BHT[(247.193±15.159) mg Trolox/g]。相關性分析顯示，RRE中超氧陰離子自由基清除能力與總黃酮含量相關性最高，與總酚含量的相關性不高。RRE的超氧陰離子自由基清除能力優(yōu)于BHT(P<0.05)，可較好地清除超氧陰離子自由基，表明RRE中某些組分具有開發(fā)為食品抗氧化劑的潛力，可以有效延緩食品氧化。

圖3 樣品與對照物的超氧陰離子自由基清除能力Fig.3 The superoxide anion radical scavenging ability of sample and control

2.2.4 鐵還原能力

FRAP法是基于氧化還原的比色法，在酸性條件下，F(xiàn)e3+與TPTZ形成Fe3+-TPTZ復合物，其在還原物質的作用下會被還原為二價鐵，呈現(xiàn)藍色，并在593 nm處具有最大吸收峰。因此，在此波長下進行吸光值變化的檢測，可以反映出樣品鐵還原的能力[27]。由圖4可知，鐵還原能力大小依次為VC[(2 016.666±28.151) mg Trolox/g]>RRE[(1 827.378±222.059) mg Trolox/g]>BHT[(1 243.333±33.664) mg Trolox/g]，RRE的鐵還原能力較強，與VC相比無顯著性差異(P>0.05)，并顯著高于BHT(P<0.05)，相關性分析也表明，F(xiàn)RAP與樣品中的總酚、總黃酮含量的相關性均較高，其相關性系數(shù)分別達到了0.953和0.997，結合樣品清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和超氧陰離子自由基的實驗結果可以得出，RRE是一種較好的天然抗氧化資源。

圖4 樣品與對照物的FRAP能力Fig.4 The FRAP ability of sample and control

2.3 α-葡萄糖苷酶活性抑制能力

治療糖尿病的關鍵措施是控制并降低患者的血糖含量，主要是通過抑制小腸上α-葡萄糖苷酶的活性，從而降低對攝入的碳水化合物的消化，延緩人體對葡萄糖的吸收來治療糖尿病。目前，國內市場上主要的α-葡萄糖苷酶抑制劑是阿卡波糖，它對Ⅱ型糖尿病有確切的療效[28]。通過測定樣品的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力，從而評估其潛在的抗糖尿病能力。由圖5可知，在一定的質量濃度范圍內，α-葡萄糖苷酶抑制能力與樣品質量濃度存在明顯的劑量-效應關系，隨樣品的質量濃度的增大而升高，其IC50值為(1.314±0.070) mg/mL，高于糖尿病臨床治療物阿卡波糖的IC50值(0.487±0.098)mg/mL(P<0.05)。但從圖5也可以看出，RRE還是具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制能力，且呈現(xiàn)劑量依賴性，可以對其活性成分進行富集和分離純化，以評估其單體化合物的α-葡萄糖苷酶抑制能力。

a-α-葡萄糖苷酶清除率；b-IC50值圖5 樣品的α-葡萄糖苷酶抑制能力Fig.5 The α-glucosidase inhibition of sample

2.4 乙酰膽堿酯酶活性抑制能力

AD又被稱為老年癡呆癥，是一種在老年人中常見的進行性發(fā)展的神經系統(tǒng)退行性疾病，主要的臨床表現(xiàn)有記憶受損和認知功能減退，嚴重影響患者的生活質量。發(fā)生AD的關鍵原因在于患者大腦中神經遞質乙酰膽堿的缺失，而乙酰膽堿酯酶可催化乙酰膽堿的裂解，使其缺失的速度加快。加蘭他敏是乙酰膽堿酯酶的競爭性可逆抑制劑，常被用于臨床治療AD的研究[29]。由圖6可知，在一定質量濃度范圍內，RRE的乙酰膽堿酯酶抑制能力與其質量濃度呈正相關，并呈現(xiàn)劑量依賴性，RRE的乙酰膽堿酯酶抑制能力的IC50值為(403.347±18.162) μg/mL，同樣也高于加蘭他敏(1.062±0.128) μg/mL(P<0.05)，也遠高于黃柏、元胡等中草藥乙酸乙酯提取物的295.12、29.09 mg/L[30]。

a-AchE酶清除率；b-IC50值圖6 樣品的AChE抑制能力Fig.6 The AChE inhibition of sample

3 結論

本研究對懸鉤子屬茅莓的根部粗提物的有效成分、體外抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶和乙酰膽堿酯酶的抑制能力進行了研究。結果表明，RRE總酚含量為446.392 mg GAE/g，總黃酮含量為638.337 mg Rutin/g。體外抗氧化試驗的結果為DPPH自由基清除能力為871.878 mg Trolox/g，ABTS陽離子自由基清除能力為1 177.854 mg Trolox/g，鐵還原能力為1 827.378 mg FeSO4/g，超氧陰離子自由基清除能力為419.928 mg Trolox/g。RRE的α-葡萄糖苷酶抑制能力的IC50值為1.314 mg/mL，乙酰膽堿酯酶抑制能力的IC50值為403.347 μg/mL。結果表明，茅莓根具有較強的體外抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶和乙酰膽堿酯酶抑制能力，可能與茅莓根體內含量豐富的酚類物質、黃酮類物質有關，具有開發(fā)成天然抗氧化劑和降血糖、預防老年癡呆的藥物的潛力。后續(xù)擬對RRE進行分離純化和結構鑒定等工作，將其運用在食品、藥品領域中，對茅莓根的開發(fā)利用具有重要的意義。