阿膠真?zhèn)舞b定方法的建立與應(yīng)用

趙云冬，王天添，陳思秀，劉玟妍，王艷雙,2，李明成，孫麗媛*

1(北華大學 醫(yī)學技術(shù)學院，吉林 吉林，132013)2(北華大學 醫(yī)學院，吉林 吉林，132013)

阿膠是采用馬科動物驢的皮經(jīng)煎煮、濃縮而制成的固體膠，也稱驢皮膠[1]。阿膠與人參、鹿茸一起被稱為“中藥三寶”。阿膠現(xiàn)今在臨床上主要用于治療勞嗽咯血、妊娠胎漏、心煩不眠等癥。此外，阿膠還具有安胎、增加體內(nèi)鈣攝入量、抗休克、抑制腫瘤、美容養(yǎng)顏等作用[2-10]。在驢皮資源短缺、原材料供應(yīng)不足的今天，出現(xiàn)了應(yīng)用馬皮、牛皮、豬皮等皮類冒充驢皮熬膠的現(xiàn)象。《中國藥典》[1]明確規(guī)定，阿膠只能采用驢皮熬制，由驢皮熬制的阿膠才具有補血滋陰潤燥的功效。偽品膠類的存在嚴重影響了我國阿膠市場的阿膠質(zhì)量，也阻礙我國阿膠產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展及阿膠復(fù)方制劑的推廣。因此，對阿膠的真?zhèn)舞b別具有重要意義。

目前針對阿膠真?zhèn)舞b別的技術(shù)眾多，包括傳統(tǒng)鑒別、理化鑒別、色譜分析及分子生物學鑒別等。傳統(tǒng)鑒別法依據(jù)外觀、顏色、表面刀切紋路、氣味等進行鑒別，主觀因素影響較大，無法鑒別深加工阿膠產(chǎn)品；理化鑒別法主要針對阿膠中無機元素及硫酸皮膚素等進行檢測，受加工工藝以及輔料添加的影響，使阿膠的分子組成、質(zhì)量分布和光譜性質(zhì)等存在差異，缺乏有效的阿膠質(zhì)量控制方法，無法保證結(jié)果準確性；色譜分析法主要檢測阿膠中膠原蛋白及其水解產(chǎn)物如明膠、多肽、多種氨基酸等，但阿膠的化學成分復(fù)雜，無準確標準，甚至有些鑒別特征并不明顯，使鑒別存在一定困難。隨著分子生物學和物種遺傳學的發(fā)展，分子生物學技術(shù)、分子納米技術(shù)和DNA分子遺傳學技術(shù)[11-15]已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥材領(lǐng)域的研究，應(yīng)用分子生物學方法鑒別阿膠中驢源性成分具有種屬特異性強、靈敏性高等特點，是目前人們研究的熱點技術(shù)。熒光定量PCR是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程的方法。具有特異性強、靈敏度高、準確性高、檢測范圍寬和操作簡單等特點，目前在臨床疾病診斷、食品安全、科學研究等[16-17]方面已有廣泛應(yīng)用。

由于阿膠加工工藝的復(fù)雜導(dǎo)致DNA嚴重降解和斷裂，致使其動物源性基因組DNA提取非常困難，因此本研究應(yīng)用DNA純化柱法[18]提取阿膠中高質(zhì)量的DNA。綜合考慮阿膠DNA的降解情況、阿膠中驢源性特異性靶基因片段的大小以及檢測成本等方面，建立阿膠SYBR Green I熒光定量PCR(polymerase chain reaction)方法鑒定阿膠真?zhèn)危ㄟ^靈敏性試驗確定檢測下限，應(yīng)用重組質(zhì)粒pGMT-Equ66 bp制備標準曲線，對22批阿膠樣品中驢源性成分進行定量分析，為實現(xiàn)阿膠的快速標準化基源鑒定提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

阿膠標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：121274-201703)；22批阿膠樣品分別由4家公司提供：吉林雙藥藥業(yè)股份有限公司(1～10號)、山東東阿百年堂阿膠生物制品股份有限公司(11～14號)、北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠(15～18號)和河北東汝阿膠有限公司(19～22號)，并經(jīng)吉林省吉測檢測技術(shù)有限公司，應(yīng)用《中國藥典》方法進行質(zhì)譜檢測，確定為正品；阿膠偽品(馬皮膠、牛皮膠、羊皮膠和豬皮膠)，由吉林雙藥藥業(yè)有限公司為本研究單獨生產(chǎn)提供。

1.2 實驗試劑

2×Taq PCR Master Mix、50 bp DNA Ladder，北京天根生化科技有限公司；2×RealStar Green Power Mixture(SYBR)，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；P1 275 μL(P2、0.5 mol/L EDTA、20 mg/mL蛋白酶K和10 mg/mL RNA酶)；P2 250 μL(1 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L EDTA、NaCl、10%(質(zhì)量分數(shù)) SDS和20 mg/mL 蛋白酶K)；P3 800 μL(5 mol/L醋酸鉀、1 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L EDTA、無水乙醇和ddH2O),實驗室配制；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

HC-150T2高速多功能粉碎機，永康市綠可食品機械有限公司；DS-11超微量紫外可見分光光度計，美國Denovix公司；TCR0024 PikoReal實時定量PCR儀、Thermo Fisher高速離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；TC1000-G PCR儀，美國賽洛捷克(Scilogex)公司。

1.4 阿膠標準品及樣品DNA提取

取阿膠樣品0.20 g，置1.5 mL EP管中，加入P1 275 μL、P2 250 μL，混勻，56 ℃水浴1 h；充分混勻后，70 ℃水浴10 min；加入異丙醇500 μL，輕輕顛倒混勻，500 r/min,5 s；將以上溶液加到DNA純化柱中，10 000 r/min,3 min，棄廢液；加入P3 700 μL，10 000 r/min,1 min，棄廢液(重復(fù)1次)；10 000 r/min,2 min，將DNA純化柱轉(zhuǎn)移入1.5 mL EP管中，加入ddH2O 50 μL，室溫放置10 min，10 000 r/min×2 min(重復(fù)1次)，即得DNA溶液，于-20 ℃保存。

1.5 DNA濃度及A260/A280檢測

用超微量紫外分光光度計測定基因組DNA的濃度及A260/A280，每個樣品測量3次，取平均值。

1.6 PCR引物設(shè)計

GenBank下載驢種屬基因序列(GenBank：X97337.1)，應(yīng)用DNAMAN設(shè)計引物，Equus asinus-66 bp：上游5′-GCCCTTATCCTTTCCATCTTA-3′，下游5′-GCTTCGTTGTTTTGACATG-3′，并在NCBI在線進行Primer-BLAST分析引物特異性，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.7 引物特異性試驗

應(yīng)用Equus asinus-66 bp對阿膠標準品、馬皮膠、牛皮膠、羊皮膠和豬皮膠進行PCR反應(yīng)，驗證引物特異性。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，引物F、R(10 ng/μL)各0.5 μL，DNA 0.5 μL，ddH2O 8.5 μL；PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s(30個循環(huán))；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.8 構(gòu)建標準陽性對照品

目的片段凝膠回收，測量濃度后，pGM-T載體16 ℃連接過夜，命名為pGMT-Equ66 bp；轉(zhuǎn)化大腸桿菌后接種平板，37 ℃過夜培養(yǎng)；經(jīng)藍白篩選轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基37 ℃空氣浴振蕩過夜培養(yǎng)；質(zhì)粒小提、測定DNA濃度、PCR擴增反應(yīng)、電泳[7]。挑選質(zhì)量濃度大于100 ng/μL且與預(yù)期目的條帶位置一致的樣本，送往生工生物(上海)股份有限公司測序。

1.9 熒光定量PCR擴增反應(yīng)

最適熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表1。

表1 最適熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件Table 1 Optimum fluorescence quantitative PCR reaction system and reaction conditions

1.10 熒光定量PCR靈敏性試驗

以1.8中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGMT-Equ66 bp作為標準，測量其質(zhì)量濃度為100 ng/μL，依次進行10倍等級稀釋(1×102～1×10-8ng/μL)，熒光定量PCR檢測，根據(jù)CT值的大小判斷熒光定量PCR檢測標準質(zhì)粒pGMT-Equ66 bp的靈敏性，根據(jù)靈敏性確定檢測下限。

1.11 制備標準曲線

阿膠標準品以1.8中構(gòu)建的100 ng/μL重組質(zhì)粒pGMT-Equ66 bp作為標準，計算其樣品拷貝數(shù)為2.96×1010copies/μL。將pGMT-Equ66 bp標準質(zhì)粒從2.96×1010copies/μL依次進行10倍等級稀釋(2.96×1010～2.96×103copies/μL)，進行熒光定量PCR，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)對照。以CT值作為縱坐標，以標準品拷貝數(shù)對數(shù)值為橫坐標繪制標準曲線。

1.12 阿膠樣品定量檢測

采用阿膠熒光定量PCR檢測方法，對22批阿膠樣品進行檢測，并依據(jù)標準曲線確定其驢源性成分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿膠基因組DNA濃度及A260/A280檢測結(jié)果

應(yīng)用DNA純化柱法提取22批阿膠樣品基因組DNA，質(zhì)量濃度為(82.17±0.09)～(172.81±1.81) ng/μL，A260/A280為(1.561±0.07)～(1.821±0.04)，其中阿膠樣品2號、3號、11號～14號、18號～22號(生產(chǎn)批號：20170701、20170801、20192401、20192402、20192403、20192404、20191701、20191702、20191703和20191704)相較其他阿膠樣品濃度較低、A260/A280較小(表2)。

表2 阿膠樣品基因組DNA濃度及A260/A280檢測結(jié)果Table 2 The results of DNA concentration and A260/A280 detection colla corii asini samples

2.2 引物特異性試驗結(jié)果

應(yīng)用PCR對阿膠標準品及偽品進行檢測，結(jié)果表明只有阿膠標準品能擴增出特異性條帶，其他偽品均未出現(xiàn)條帶(圖1)。

M-50 bp DNA Ladder；1-阿膠標準品；2-馬皮膠；3-牛皮膠； 4-羊皮膠；5-豬皮膠；N-空白對照圖1 阿膠普通PCR檢測特異性結(jié)果Fig.1 The result of colla corii asini general PCR detection specificity test

2.3 構(gòu)建標準陽性對照品結(jié)果

重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、電泳后在66 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖2)，與預(yù)期目的條帶位置一致。測序結(jié)果經(jīng)比對分析后與GenBank中已登記的驢物種相似性為100%(圖3)，說明克隆重組質(zhì)粒pGMT-Equ66 bp可作為鑒定阿膠驢源性DNA的標準陽性對照品。

圖3 目的基因序列測序結(jié)果和比對結(jié)果Fig.3 The results of target gene sequence sequencing and alignment test

2.4 熒光定量PCR特異性試驗結(jié)果

對阿膠標準品及其偽品進行檢測，結(jié)果表明只有阿膠標準品成功擴增，偽品均未出現(xiàn)擴增，熔解曲線在76.1 ℃處出現(xiàn)單一峰，特異性好，無引物二聚體(圖4、圖5)。

圖4 阿膠熒光定量PCR檢測特異性結(jié)果Fig.4 The results of colla corii asini fluorescence quantitative PCR detection specificity test

圖5 阿膠熒光定量PCR檢測特異性熔解曲線結(jié)果Fig.5 The results of colla corii asini fluorescence quantitative PCR detection specificity melting curve test

2.5 熒光定量PCR靈敏性試驗結(jié)果

靈敏性結(jié)果表明，模板質(zhì)量濃度高于1×10-7ng/μL時擴增曲線有明顯基線期、指數(shù)增長期和平臺期，故認為檢測下限為1×10-7ng/μL，此時CT值為32。由此確定當待檢阿膠樣品CT值小于32時，認為是阿膠正品(圖6)。

A-100 ng/μL；B-10 ng/μL；C-1 ng/μL；D-1×10-1 ng/μL； E-1×10-2 ng/μL；F-1×10-3 ng/μL；G-1×10-4 ng/μL； H-1×10-5 ng/μL；I-1×10-6 ng/μL；J-1×10-7 ng/μL； K-1×10-8 ng/μL圖6 阿膠熒光定量PCR靈敏性檢測結(jié)果Fig.6 The results of colla corii asini fluorescence quantitative PCR detection sensitivity test

2.6 標準曲線制備結(jié)果

選取CT值為13～30的5個梯度(2.96×104～2.96×108copies/μL)的重組標準質(zhì)粒pGMT-Equ66 bp進行熒光定量PCR，結(jié)果表明，均呈“S”型擴增(圖7)。熔解曲線呈單一峰，特異性好(圖8)。以CT值作為縱坐標，以標準品拷貝數(shù)對數(shù)值作為橫坐標建立標準曲線(圖9)，標準曲線方程為y=-3.13x+37.362，相關(guān)系數(shù)R2= 0.990 8，可信度高。

A-2.96×108 copies/μL；B-2.96×107 copies/μL； C-2.96×106 copies/μL；D-2.96×105 copies/μL； E-2.96×104 copies/μL圖7 阿膠不同濃度標準質(zhì)粒擴增曲線結(jié)果Fig.7 The results of amplification curves of standard plasmids with different concentrations of colla corii asini

圖8 阿膠不同濃度標準質(zhì)粒熔解曲線結(jié)果Fig.8 The results of melting curve of standard plasmids with different concentrations of colla corii asini

圖9 阿膠熒光定量PCR標準曲線Fig.9 Colla corii asini fluorescence quantitative PCR standard curve

2.7 阿膠樣品熒光定量檢測結(jié)果

將22批阿膠樣品進行定量檢測，結(jié)果表明，22批阿膠樣品的CT值為19.83～28.85，均小于32，大于檢測下限，為正品，與《中國藥典》方法質(zhì)譜檢測結(jié)果一致；其中，阿膠1號、4號～10號、15號～18號樣品的CT值為19.83～23.16，拷貝數(shù)為104.54～105.60copies/μL；阿膠2號、3號、11號～14號、19號～22號樣品的CT值為27.72～28.85，拷貝數(shù)為102.72～103.08copies/μL(表3)。

表3 阿膠樣品熒光定量檢測結(jié)果Table 3 The results of fluorescence quantitative test results of colla corii asini samples

3 討論

阿膠是滋補養(yǎng)血的中藥，水解后產(chǎn)生多種氨基酸，如L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸等，具有安胎、抑瘤、美容養(yǎng)顏等作用。阿膠可用黃酒或開水烊化直接食用，可加入蛤粉或蒲黃文火拌炒制成阿膠珠服用，也可作為重要原材料配伍相關(guān)中藥材治療相關(guān)疾病。阿膠市場需求量的上升，致使驢皮——阿膠的唯一原材料也供不應(yīng)求。巨大的經(jīng)濟利潤致使一些不法商販違背良知，應(yīng)用馬皮、牛皮等熬制阿膠。真假阿膠雖然外觀相似，但功效顯著不同，阿膠偽品不僅沒有保健價值，而且可損害消費者身心健康[19]。阿膠偽品的存在嚴重擾亂了阿膠市場的平衡，嚴重損害并阻礙了阿膠產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此，亟待建立一種高效、簡便、快速的方法鑒別阿膠真?zhèn)巍?/p>

本研究所采用的阿膠標準品(批號：121274-201703)購自中國食品藥品檢定研究院；22批阿膠樣品，經(jīng)吉林省吉測檢測技術(shù)有限公司，采用《中國藥典》方法質(zhì)譜檢測，檢測結(jié)果均為正品；阿膠偽品(馬皮膠、牛皮膠、羊皮膠、豬皮膠)由吉林雙藥藥業(yè)有限公司為本研究單獨生產(chǎn)提供。阿膠因長時間高溫熬煮，其DNA高度降解、斷裂。因此，從阿膠中提取DNA較為困難。本團隊改進了酚/氯仿法提取DNA的方法，建立了阿膠驢源性DNA提取方法——DNA純化柱法。DNA純化柱法提取的DNA質(zhì)量濃度為(82.17±0.09)～(172.81±1.81) ng/μL，A260/A280為(1.561±0.07)～(1.821±0.04)，說明DNA純化柱法提取的DNA能滿足后續(xù)PCR實驗要求。DNA純化柱法可在90 min內(nèi)從深加工的阿膠中提取高質(zhì)量的動物源性基因組DNA，步驟簡便、用時短、經(jīng)濟適用且無毒害作用，可滿足PCR等鑒定實驗的要求，為阿膠分子生物學鑒定提供高質(zhì)量待檢DNA。

在GenBnak中選取驢種屬CytB基因序列，應(yīng)用DNAMAN設(shè)計驢源性特異性引物。對阿膠標準品及其偽品應(yīng)用Equus asinus-66 bp進行特異性試驗，最適退火溫度為60 ℃時，只有阿膠標準品在66 bp處出現(xiàn)單一、特異性條帶，其他偽品均不出現(xiàn)條帶。本研究應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pGMT-Equ66 bp，經(jīng)測序比對分析后，與GenBank中已登記的驢(GenBank：X97337.1)物種同源性為100%，與其他物種無匹配，可作為阿膠驢源性DNA標準陽性對照品。構(gòu)建的質(zhì)粒易于保存，穩(wěn)定性好，利于阿膠分子生物學檢測技術(shù)在基層廣泛推廣。

熒光定量PCR 是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對 PCR 產(chǎn)物進行標記跟蹤， 實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程的方法。具有特異性強、靈敏度高、準確性高、檢測范圍寬和操作簡單等特點。綜合考慮阿膠 DNA 的降解情況、阿膠中驢源性特異性靶基因片段的大小以及檢測成本等方面，選擇熒光染料(SYBR Green I)法對阿膠真?zhèn)巫鲞M一步鑒別。熒光定量PCR特異性檢測結(jié)果表明，只有阿膠標準品成功擴增，偽品均未出現(xiàn)擴增，且熔解曲線在76.1 ℃呈單一峰，未出現(xiàn)非特異性擴增，說明特異性好。熒光定量PCR靈敏性檢測結(jié)果表明，模板質(zhì)量濃度高于1×10-7ng/μL時擴增曲線有明顯基線期、指數(shù)增長期和平臺期，因此認為檢測下限為1×10-7ng/μL，此時CT值為32。由此確定當待檢阿膠樣品CT值小于32時，認為是阿膠正品。

應(yīng)用構(gòu)建的重組標準質(zhì)粒pGMT-Equ66 bp，測量其濃度并計算其初始拷貝數(shù)為2.96×1010copies/μL，依次10倍等級稀釋進行熒光定量PCR。選取CT值為13～30的5個梯度(2.96×104～2.96×108copies/μL)的pGMT-Equ66 bp，以CT值為縱坐標，濃度對數(shù)為橫坐標建立標準曲線，阿膠熒光定量PCR標準曲線為y=-3.13x+37.362，相關(guān)系數(shù)R2=0.990 8，可信度高。

應(yīng)用所建立的阿膠SYBR Green I熒光定量PCR方法對22批阿膠樣品進行定量分析，22批阿膠樣品的CT值為19.83～28.85，均小于32，經(jīng)熒光定量PCR鑒定為正品，其檢測結(jié)果與《中國藥典》方法質(zhì)譜檢測結(jié)果一致，說明熒光定量PCR靈敏性更高、特異性強。與《中國藥典》中對阿膠特征分子離子峰及4種氨基酸含量進行檢測的方法相比，《中國藥典》方法檢測時間長、檢測的氨基酸無種屬特異性；本研究所建立的阿膠SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法，對阿膠中驢源性DNA進行檢測，追蹤溯源從阿膠原材料驢皮的基因水平鑒定真?zhèn)危瑱z測的種屬特異性更強、靈敏度更高，所需時間更短；并且本研究已應(yīng)用所建立的阿膠SYBR Green I熒光定量PCR檢測體系對阿膠標準品做出標準曲線，根據(jù)檢測數(shù)據(jù)差異，可獲悉所檢測樣本中是否存在其他動物源性膠類摻假情況。

綜上所述，本研究建立的阿膠SYBR Green I熒光定量PCR檢測體系可快速檢測阿膠樣品真?zhèn)危c《中國藥典》方法檢測結(jié)果一致，且特異性強、靈敏性高，從分子生物學角度解決了阿膠樣品真?zhèn)舞b定問題。