廢用性骨質疏松動物模型的研究進展

楊琛 李興勇 張超 楊浩 黃琛 左鵬剛

1. 甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730030

2. 甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730030

廢用性骨質疏松癥(disuse osteoporosis, DOP)是由于骨骼機械負荷力的減少而引起局部或全身骨量丟失的疾病。DOP可發生于脊髓損傷不能運動的患者以及其他由于疾病或手術而長期臥床休息的患者，此外，宇航員長期處于太空失重環境下，其骨組織(尤其是下肢)由于缺乏正常的機械負荷刺激也會發生廢用性骨質疏松[1]。DOP發生骨折的危險程度是正常人的4倍，為家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔[2]。了解DOP的病因及發病機理，對于預防和治療DOP具有重要的臨床意義。當前對DOP的病因病機學研究取得了一定進展，但其具體的發病機制目前仍尚未完全明確[3]。

動物模型在臨床前研究中發揮著不可替代的作用，理想的動物模型對研究DOP的病因病機、發展過程、積極預防和藥物治療等具有重要意義。常用于構建廢用性骨質疏松模型的動物有大鼠、小鼠、冬眠熊、火雞、豬、猴子靈長類動物模型等。目前研究中常用的DOP動物模型有去勢法動物模型、固定法動物模型和其他類型動物模型(圖1)，現將以上造模方法進行總結，為該病的造模研究提供有價值的參考依據。

圖1 常見的廢用性骨質疏松動物模型的造模方法

1 去勢法動物模型

1.1 脊髓切斷模型

此種造模方法具體為，剪開大鼠的皮膚，剝離肌肉組織，在T10水平行椎板切除術，將脊髓完全橫切，脊髓橫斷10 d后，開始出現DOP癥狀[4]。Jiang等[5]應用此法的結果顯示，去脊髓大鼠ALPase活性、前膠原和骨鈣素的產生以及骨鈣素、Runx2和成骨相關轉錄因子抗體的基因表達以及成骨細胞活性明顯低于后肢固定大鼠，即去脊髓大鼠成骨細胞對機械負荷的反應低于對照組。Otzel等[6]使用T9椎板切除術聯合中重度脊髓挫傷造模法的結果表明，此模型顯示松質骨迅速退化，皮質骨逐漸喪失，并出現全骨機械缺陷，類似于在運動完全性脊髓損傷人群中觀察到的后遺癥，提出低睪酮和(或)瘦素可能是脊髓損傷后骨退化的分子機制的設想。

1.2 坐骨神經切除模型

其造模方法為，通過手術法切除模型動物的單側坐骨神經，造成一側肢體的運動障礙而發生DOP。Brouwers等[7]將此模型與去卵巢大鼠模型的骨量丟失作比較，發現坐骨神經大鼠模型的骨小梁數量、分離情況及骨骺端的連接性明顯比去卵巢大鼠模型差，即廢用模型比去卵巢模型的骨結構和機械性能更差。Desouza等[8]通過延長這種模型動物的脛骨長度來驗證恢復老齡小鼠的負荷反應，發現隨著年齡的增長，長期延長脛骨會使機械適應能力下降，增強骨皮質強度而非骨小梁強度。此模型多用于藥物研發[9-10]。

1.3 臂叢神經切除模型

該模型的造模方法為，將兔模型麻醉后切開暴露術野，分離全臂叢神經到神經根孔處切斷并向遠端游離2 cm切斷后曠置，縫合，造成該側肢體運動障礙而逐漸出現DOP[11]。該模型造模原理與坐骨神經切除模型原理相似，但既往文獻中關于此種模型的報道較少。

2 固定法動物模型

2.1 尾部懸吊模型

尾部懸吊模型是目前使用最廣泛的DOP造模方法，具體[12]為，使用70 %的乙醇清洗動物尾巴后涂上安息香酊劑，將外科手術膠帶綁在尾巴的末端形成一個環，再用三條彈性膠帶固定手術膠帶，將環連接到頭頂的橫桿上，并且橫桿的高度需要調節以使動物后腿被抬高到籠子的地板之上且頭朝下傾斜30 °，人為的造成動物失重或者模擬失重狀態，使骨質水平降低，鈣磷代謝處于負平衡，最終導致骨質丟失。后肢懸吊廢用可引起DNMT1的上調和啟動因子H19的高甲基化，這導致了lncRNA-H19的下調和ERK信號的抑制[13]。Paiva等[14]的研究表明在正常大鼠和尾部懸吊致DOP大鼠的骨愈合中，骨量減少不影響骨愈合過程，無論骨折是否骨質減少，時間都是一個獨立的決定因素。也有學者發現在最初廢用期后和隨后廢用期后采用中等強度的阻力訓練并不能改善DOP嚴重程度[15]。目前該模型在藥物(特別是中醫藥)抗DOP的作用和作用機理方面應用廣泛[16]。

2.2 腿尾固定模型

具體造模方法為，消毒后的0.1 mm醫用鋼絲穿過后肢一側踝部松緊適宜地固定到距肛門1～2 cm尾根處，一般4周即可造成DOP動物模型[17]。唐學陽等[18]為研究DOP對維生素D受體表達的關系，使用此法將大鼠分別固定2周和4周，采用免疫組織化學和圖象分析方法檢測固定對DOP大鼠模型VDR表達的影響，結果發現幼鼠固定側肢體骨VDR表達的增強與固定有關。成勇等[19]對此模型進行了改進，即在距大鼠肛門1 cm的尾根部纏繞醫用膠帶，以加大鐵絲的受力面積，從而減輕鋼絲對尾部的壓迫。

2.3 石膏繃帶固定模型

該模型適用于犬、家兔等體積中等的動物。造模方法為，使用石膏繃帶將動物的一側后肢包裹2～3層，石膏繃帶每兩周更新一次以防止石膏繃帶松動或肢體發生壓瘡[20]。馬信龍等[21]通過實驗研究發現石膏繃帶固定誘發DOP模型大鼠脛腓骨在不同時間點之間的最大負荷、彈性模量與鈣含量都明顯低于正常大鼠，且馬森染色顯示隨著廢棄時間推移，膠原蛋白逐漸減少，說明DOP是由肌肉不活動和負重減少引起。通過石膏繃帶固定DOP模型，可以很好地理解骨、關節軟骨、肌肉、神經和血管的變化。

3 其他類型動物模型

3.1 藥物誘發模型

Chappard等[22]描述了一種使用肉毒桿菌毒素(botulinum toxin, BTX)麻痹大鼠后肢肌肉的模型，以研究廢棄對骨骼的影響。BTX是一種神經毒性蛋白質，由肉毒桿菌產生。BTX充當蛋白酶，用于阻隔運動終板突觸前部分的SNARE復合體的SNAP-25，從而抑制乙酰膽堿泡停靠突觸前膜。因此，用BTX注射會使骨骼肌癱瘓，導致注射肢體的固定。但BTX導致的廢用是非永久的，一般情況下注射BTX后4～5 d開始癱瘓，8～9 d承重能力部分恢復。BTX主要用于小鼠、大鼠和兔子，其具體造模方法為，根據研究的部位而選擇相應部位肌肉注射BTX。Vegger等[23]分別對雌性的16周齡小鼠和44周齡小鼠的同一后肢注射BTX，通過觀察同一部位骨強度和骨密度，結果表明幼鼠和老齡鼠的骨量丟失無顯著差異。該模型為可逆轉模型，且在評價藥物治療DOP的作用和設備研究方面應用廣泛[24-25]。

3.2 基因工程誘導模型

該造模原理是模擬人體因某種基因突變或表達異常而發生DOP，主要通過對某些基因的失活、突變或增強表達，以此來研究這種基因在DOP發病過程中的作用機理，這有助于DOP的診斷與治療。Akhter等[26]為確定LRP5 G171 V突變是否能防止廢棄相關的骨量丟失，測量了野生型、LRP5敲除型和帶有LRP5 G171 V突變型小鼠的骨小梁厚度等指標，發現LRP5敲除型的骨小梁數量和厚度減少20 %，而LRP5 G171 V突變型減少6 %～11 %。目前證實的與DOP有關的基因包括Lrp5、LRP6、LncRNA-H19、Sost、(Cx)37、β連環蛋白、BCL2等[27-29]。

3.3 冬眠熊模型

冬眠熊模型是研究人DOP的極好模型，因為冬眠是肌肉骨骼廢棄不用的自然模式，且熊和人類有相似的下肢骨骼形態，熊能像人類一樣走路。冬眠熊在長時間廢用(即冬眠)期間不會出現DOP[30]。Donahue等[31]將圈養冬眠熊放置在與其體積對應的鋪好稻草的涵洞中，它們在冬眠期間是不活躍的，觀察4～4.5個月，發現熊會每天進行3～4次顫抖(發抖)。熊的這種顫抖(發抖)可能足以通過一種涉及低強度、高頻機械刺激的機制來維持小梁骨量和微結構，因此現在的研究中也有學者通過低強度、高頻機械刺激來探索對DOP的作用[32]。由于熊的價格與飼養成本較高，目前國內還沒有相關文獻報道。

3.4 聯合造模法誘發的DOP模型

DOP發病機制復雜，發病因素多樣化，因此采用多因素聯合造模或同一試驗中使用兩種以上的造模方法具有很大的意義與應用價值。聯合造模法還具有造模周期較短，造模效果好等優勢，因而在近年來應用較多。如CIZ基因缺陷型聯合尾部懸吊法[33]、去卵巢聯合尾部懸吊法等[34]。Niziolek等[35]在兩種不同的Lrp5 高骨量基因敲入小鼠模型中，利用尾部懸吊法和藥物BTX誘發法發現，Lrp5高骨量等位基因提供了顯著的保護，防止廢棄的再吸收效應和雌激素的戒斷，因此，提供了一個潛在的機制來模擬藥物干預，以防止各種骨浪費。

4 討論

DOP動物模型為認識DOP的生理病理特點和驗證藥物的治療效果提供了一種較為科學的手段和方法。理想的動物模型設計應符合相似性、方便性、關聯性和適宜性的原則。目前各類模型動物各有特點，造模的方法也各有側重，因此所制作的模型動物往往只能在某些方面如病因、臨床癥狀或病理變化表現出DOP的特征。

去勢法造模通過手術的方法切斷脊髓或神經從而達到局部廢用而產生DOP，固定法造模通過非手術方法固定局部肢體或使肢體失重達到廢用效果而產生DOP，一般來說手術造模產生DOP的速度要快于非手術方法[36]。這兩類造模多適用于藥物的研發；尾部懸吊誘發的DOP動物模型為應用最廣泛的造模方法之一，雖然此法常易使模型鼠尾部潰爛，但其對骨骼廢用過程中抑制和恢復骨形成所需的時間較短且可預測，還可對同一動物的廢用骨骼和正常骨骼進行直接比較，因此，該模型有助于研究體內骨形成的調節因素；藥物BTX造模法操作簡單且具有可逆性，可模擬急性廢用產生的DOP。但應認識到BTX具有很強的不良反應，BTX中的肉毒桿菌毒素底物-1可以降解骨骼中的有機物和無機物且參與了破骨細胞的分化通路[37]，這可能會影響實驗結果；基因工程造模法是近年來隨著基因研究的深入而逐漸發展起來的一種新興造模方法，可從基因層面探索DOP與基因的關系從而達到精準治療，但由于基因工程造模操作難度系數和費用較高[38]，目前該領域的相關研究較少；冬眠熊與人類有相似的下肢骨骼系統，但長時間廢用(冬眠)而不會產生DOP，因此研究冬眠熊的骨代謝機制可為治療人類DOP提供有價值的見解。但由于我國地理位置原因，冬眠熊資源短缺，獲取成本高，未曾發現有相關文獻報道。

我們應該認識到動物與人類在骨質構造方面存在差異，因此只能間接的模擬人類疾病，而不能完全替代人類疾病，只有在動物模型與人類DOP發病機制和病例特點相似的情況下，DOP動物模型的實驗才有借鑒意義。隨著人們對DOP研究的深入，DOP建模方法及評價方法也在不斷完善，人們認識到DOP可能是由多因素引起，因此采用聯合造模方法反而更能模擬出與人類DOP發病機制相似的動物模型且更貼近于臨床實際，未來還需進行更多的研究甚至進行動物循證學的研究來證明其優越性。