上海地區黃瓜莖基腐病的病原鑒定

曾 蓉,高 萍,丁國強,宋志偉,高士剛,徐麗慧,戴富明*

(1上海市農業科學院生態環境保護研究所∕上海市設施園藝技術重點實驗室,上海201403;2上海市農業技術推廣服務中心,上海201103)

我國是黃瓜種植面積和產量最大的國家,據聯合國糧食及農業組織(FAO)統計,2018年我國黃瓜種植面積為105萬hm2,產量達5 629萬t。上海市的黃瓜種植面積每年超過4 000 hm2,在上海的蔬菜供給中占有重要地位。

黃瓜上常發的細菌性病害的病原菌通常有2種:丁香假單胞流淚致病變種(Pseudomonas syringaepv.lachrymans,Psl)和胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense,Pcb)。Psl能引起黃瓜細菌性角斑病,葉片上出現枯斑、穿孔,嚴重時在果實、枝條上產生菌濃,有流膠癥狀,在我國各地均有發生;同時,Psl還是西瓜細菌性果腐病、甜瓜細菌性葉斑病等病害的病原,在甘肅、新疆、遼寧、山東等多個省有發生[1-3]。Meng等[4]報道,Pcb近年來在我國山東、陜西、河北、河南和遼寧等省都有發生,引起黃瓜細菌性莖軟腐病。Pcb寄主范圍廣,包括黃瓜[3-4]、土豆[5]、番茄[6]、甜菜[7]、辣椒[8]、馬蹄蓮[9]等多種重要經濟作物,主要引起根、莖腐爛,造成作物萎蔫、死亡,嚴重影響作物的產量和經濟效益。

2020年5月,本課題組在上海市浦東新區祝橋鎮和青浦區練塘鎮設施栽培黃瓜上發現一種細菌性病害,黃瓜在莖稈基部上表現腐爛、開裂,并伴有流膠的癥狀,隨著病情加重最終導致整株萎蔫、枯死。本研究根據柯赫氏法則分離、純化病原菌,并通過形態特征、16S rRNA和RNA聚合酶β基因(rpoB)測序、特異性引物鑒定等方法進行鑒定,以期確定引起該細菌性病害的病原,為該病害的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 病害調查及癥狀觀察

2020年5月,在上海市浦東新區祝橋鎮和青浦練塘鎮設施栽培黃瓜上發現部分莖稈流膠、莖基部潰爛,后期整株萎蔫、死亡等癥狀,田間病株發生率為10%—20%。

1.2 病原物的分離、培養

采集有典型特征的病害樣品,采用稀釋分離法分離病菌。在病健交界部位切取大小約為3 mm×3 mm的組織,用75%(體積分數)的酒精表面消毒1 min后無菌水沖洗3次,無菌濾紙吸干水分;將組織放入離心管,加入無菌水后將組織搗碎,通過倍比稀釋制成10-4、10-6、10-8的稀釋菌液,每個稀釋度各取100μL分別涂布于NA培養基表面,28℃黑暗培養,待菌落長出后挑取優勢菌群的單菌落純化,經過兩代純化,得到純化的分離物PD05123-2-2。

1.3 煙草過敏反應及黃瓜致病性測定

將純化的菌株在NA培養基上28℃培養24 h,用無菌水配制成濃度約1×108cfu∕mL的細菌懸浮液,采用浸潤注射法接種到5—6真葉煙草葉片下表皮上,在26—28℃條件下保持24—48 h,檢查過敏性反應。

根據柯赫氏法則,將分離物分別回接到黃瓜4葉期苗及成熟的黃瓜果實,參考孟祥龍[3]的方法進行接種,持續觀察癥狀。

1.4 病菌PCR鑒定及序列分析

細菌基因組DNA提取參考Harju等方法[10]。除對16S rRNA進行鑒定外,還對rpoB基因序列進行測定,并利用Psl、Pcb、胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種(P.carotovorumsubsp.carotovorum,Pcc)的特異性引物進行PCR鑒定確認。用于細菌鑒別的引物如表1所示,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR檢測使用20μL反應體系,包括1×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)(北京全式金生物技術有限公司),上下游引物500 nmol∕L,模板DNA 1μL。PCR反應程序參考各引物出處文獻。

所測得的序列與GenBank數據庫進行BLASTn比對,并從數據庫中挑選與試驗菌株鄰近屬、種的16S rRNA基因序列,然后利用MEGA 7軟件,采用鄰近法(Neighbor-joining,NJ)進行1 000次Bootstraps檢驗,構建系統發育樹[11]。

表1 細菌鑒別所用引物Table 1 Primers for identification of bacteria

2 結果與分析

2.1 田間發生危害癥狀

經調查,病害發生在設施栽培采收期的黃瓜植株上,病株發生率為10%—20%,癥狀主要表現為:植株莖稈中上部開裂,在早晨可見流出乳白色膠狀物(圖1A),后期膠狀物干枯,變為黃褐色;若侵染莖基部,則引起莖基部腐爛,后期整株死亡(圖1B、C)。

圖1 黃瓜莖基腐田間癥狀與接種癥狀Fig.1 Symptoms of cucumber stem rot in field and inoculation symptoms

2.2 病原菌致病性

將病原菌分離物PD0513-2-2進行煙草下表皮接種,24 h后出現過敏壞死反應,說明分離物可能具有致病性。

病原菌噴霧接種的黃瓜(‘申青1號’)與田間癥狀相似,也會出現莖稈流膠、腐爛的癥狀(圖1D),后期也會因腐爛加重而枯死;在果實上,接種部位也出現褐變、腐爛的癥狀,接種部位附近有白色菌濃出現(圖1E)。

2.3 病原菌形態

病原菌分離物在NA培養基上菌落呈圓形,灰白色(圖2),有很濃烈的臭味;在KB培養基上,菌落呈圓形,灰白色,半透明,邊緣光滑,紫外燈照射下無熒光反應;革蘭氏染色呈陰性。

圖2 PD0513-2-2在NA培養基上的形態特征Fig.2 Morphological characteristics of PD0513-2-2 colony on NA medium

2.4 病原菌分子生物學鑒定

對病原菌PD0513-2-2的16S rRNA序列進行PCR擴增,得到1 449 bp的目的片段。測序結果與GenBank中的序列庫進行BLASTn分析表明,其與MH778 573.1(Pcb WBC12分離物)序列的相似性為99.86%,與鄰近屬、種的系統發育樹結果顯示(圖3):PD0513-2-2與NCBI核酸數據庫參考序列中的NR118228(Pcb 212)聚成一族,判斷該菌可能為胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種。

為進一步確認該病原,對PD0513-2-2分離物rpoB基因進行克隆及特異性引物PCR鑒定。BLASTn分析表明,rpoB基因序列與CP009 769.1(Pcb BC1分離物)序列相似性為97.14%。應用果膠酸鹽裂解酶基因(pelY)特異性引物Y1∕Y2和Pcb 16S-23S基因間隔區(IGS)檢測分離物PD0513-2-2,結果為陽性;應用Psl的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(gpd)特異性引物PslF∕PslR和Pcc特異性PCR引物ECCR1∕ECCF2檢測分離物PD0513-2-2,結果為陰性,進一步確認該分離物為胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense)。

圖3 基于NJ法構建的16S rRNA系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA based on NJ method

3 討論

本研究通過對引起上海黃瓜莖腐病的病原菌形態特征、致病性、生理生化特性鑒定、16S rRNA、ropB基因序列分析以及特異性PCR檢測,確定該病原菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(P.carotovorumsubsp.brasiliense)。這是上海市首次發現胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種引起黃瓜莖基腐病。

胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacterium carotovorum)最初被分在歐文氏菌屬(Erwinia)中,后又將產生果膠酶特性的一類菌重新劃分到新的果膠桿菌屬(Pectobacterium),胡蘿卜軟腐果膠桿菌的種內遺傳性比較多樣,又被分為胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(Pcb)等多個亞種[17]。胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(Pcb)被列入分子植物病理學中排名前十位的植物致病細菌[18],果膠桿菌類細菌大都引起植物果實、莖稈、根等腐爛類似的癥狀,寄主范圍也非常廣,通過果膠酶與群體感應等作用機制致病[19-20]。Pcb與同屬的其他亞種相比,有著更強的環境適應性,在巴西、美國、南非、以色列等國有發生報道,我國則以北方省市為主,上海屬于首次發現該病原菌引起病害,在長江中下游地區也未見報道。據調查,胡蘿卜軟腐果膠桿菌田間自然侵染黃瓜主要危害黃瓜的莖稈基部(呈腐爛癥狀),其次為上部莖稈(呈流膠癥狀),未見危害瓜條的癥狀。李煥玲[21]、熊凱琳等[22]鑒定的黃瓜細菌性莖軟腐病病原均能引起黃瓜果實的流膠癥狀。本研究組曾在田間黃瓜上接種Pcl,一般在葉片上引起角斑病的典型癥狀,果實上無癥狀;但通過溝灌等措施,加上大棚內濕度,黃瓜果實上便會呈現明顯的流膠癥狀。推測黃瓜細菌性莖軟腐在田間危害黃瓜部位的差異,可能與不同地區病害發生時大棚氣候特別是濕度等環境因子有一定相關性,需進一步驗證。

據調查,本次2個發病點的黃瓜均是嫁接黃瓜,且均來自省外同一供應商,因此不排除病原菌外來輸入的可能。上海作為重要的貿易城市,種子、種苗的調運會加速病原菌的傳播。這是胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種侵染危害黃瓜在上海及長江中下游地區的首次發現,鑒定和明確黃瓜莖基腐病的病原,有助于了解病害發生、流行規律,為該類病害的防治提供技術支持。