種子無氧貯藏方法的建立

吳凌云,姚東偉,李 明,GROOT Steven P.C.

(1上海市農業科學院設施園藝研究所,上海市設施園藝技術重點實驗室,上海201403;2瓦赫寧根大學與研究中心,瓦赫寧根植物研究所,瓦赫寧根6700 AA)

種質庫中種子生活力保持非常重要[1]。種子壽命主要受其本身的遺傳特性、初始種子質量及貯藏環境等因素的影響。溫度和種子水活度是影響種子老化的主要因素[2-6]。自1960年來,盡管很多研究表明無氧或低氧貯藏可以延長種子壽命[7-13],但關于種子無氧或低氧貯藏環境的建立方法卻鮮有報道。

脫氧劑作為添加劑,已在食品行業中廣泛應用[14]。絕大多數脫氧劑是依靠其中的鐵粉的氧化達到去除氧氣的目的[15],其化學反應如下:

反應式中的水通常來源于所貯藏的食品。當貯藏干物質時,則需要在加入鐵粉的同時加入增濕劑,2015年Groot等[13]應用脫氧劑Ageless ZPT?(具有增濕劑)和干燥珠zeolite seed Drying Beads?貯藏引發并丸粒化的芹菜種子,提高了引發的芹菜種子的生活力,即能在35℃時貯藏17 d以上。充氮氣是指種子包裝中充入高壓氮氣,以替換種子包裝中的空氣。真空包裝常用于基因庫種子的長期貯藏,其優點是體積小,易于檢查其密封性。

水活度即平衡相對濕度(equilibrium relative humidity,ERH),是指在相同溫度下,樣品的蒸汽壓(p)與純水的蒸汽壓(p0)的比值[16]。種子水活度(aw)是指種子中可發生水合作用的水分的量,即游離水的含量,能精確反映不同類型的種子(粉質種子、蛋白質種子和油質種子)中的水分狀態。本試驗通過研究加入脫氧劑、充氮氣和真空包裝三種方法對種子貯藏環境中氧氣水平、相對濕度及種子水活度的影響,旨在為種子無氧或低氧貯藏技術的研究和應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胡蘿卜種子(Daucuscarota L.),荷蘭bejo種子有限公司提供。

水活度儀(HygroLab Bench Top Indicator version 4,瑞士Rotronic公司),溶氧儀(Fibox 3 LCD trace fiber optic oxygen transmitter,德國PreSens公司),溫濕度記錄儀(EasyLog EL-USB-2,英國Lascar公司)

1.2 充氮氣試驗

分別取1 g、5 g、25 g 30%相對濕度下平衡的種子及9個紙袋(0.2 g種子∕紙袋),放置于194 mL帶蓋玻璃瓶中并密閉。1 h后,打開玻璃瓶取出種子測定aw。測完后,立即將種子放回玻璃瓶,并用帶孔的瓶蓋蓋緊,然后以0.5 L∕min流速分別往玻璃瓶中充入氮氣30 s、60 s、90 s、105 s、120 s,充氣完成后,瓶蓋立即用鋁箔膠帶封嚴。以不充氮氣的玻璃瓶作為對照。1 h后測定玻璃瓶中的氧氣含量。3 d后打開玻璃瓶,測定種子aw。重復3次。

1.3 真空包裝試驗

取1 g 30%相對濕度下平衡的種子,測定其aw后裝入鋁箔袋中,并使用真空密封機進行真空密封。密閉玻璃瓶中樣品為對照。3 d后測定種子aw。重復3次。

1.4 脫氧劑試驗

1.4.1 4種脫氧劑去氧效果測定

稱取4份1 g 30%相對濕度下平衡的種子,分別置于194 mL貯藏瓶中。向貯藏瓶中分別加入脫氧劑(表1),對照瓶不加脫氧劑,立即擰緊瓶蓋。分別于0 d、24 d、50 d、99 d、191 d后測定貯藏瓶中氧氣含量,記錄試驗期間貯藏瓶內相對濕度。

表1 脫氧劑特性Table 1 Characteristics of the oxygen absorbers

1.4.2 硅膠吸附和解吸曲線繪制

硅膠的吸附曲線測定:將2 kg NaCl和500 mL水混勻后放置于帶蓋的塑料盒子(長40 cm,寬20 cm,高30 cm),盒子頂部裝有兩個5 V風扇,塑料盒蓋四周密封,放置于20℃恒溫間。放置12個裝有20 g完全干燥硅膠的小培養皿(直徑5.3 cm,高度1.3 cm)于塑料盒內。0 h、6 h、10 h、24 h、48 h、72 h、98 h、124 h、144 h、168 h、192 h、220 h后各取出1培養皿硅膠,放入127 mL玻璃瓶并立即密閉。測定硅膠的水份含量和水活度,重復3次。

硅膠解析曲線測定:將2 kg NaCl和500 mL水混勻后放置于上述帶蓋的塑料盒子內,放置11個裝有20 g硅膠的培養皿在塑料盒子里,平衡6 d。往塑料盒子內放入500 g干燥珠,隨后每天加入50 g干燥珠,0 h、5 h、10 h、24 h、48 h、72 h、96 h、103 h、146 h、168 h、193 h后分別從塑料盒內取出1培養皿硅膠,放入127 mL玻璃瓶并立即密封。測定硅膠的水份含量和水活度,重復3次。

1.4.3 Wonderkeep RP-100脫氧劑去除氧氣過程中釋放的水分測量

精確稱量5 g zeolite seed Drying Beads?干燥珠,連同1包Wonderkeep RP-100脫氧劑放置于194 mL玻璃瓶中,蓋緊瓶蓋。以不加脫氧劑,僅加入5 g干燥珠的處理為對照。10 d后分別測量加入脫氧劑和未加入脫氧劑的貯藏瓶中干燥珠的重量,兩者差即為Wonderkeep RP-100脫氧劑去除氧氣過程中釋放的水份。重復5次。

1.4.4 Wonderkeep RP-100脫氧劑和硅膠去氧系統測試

設置3個處理:(1)1包Wonderkeep RP-100脫氧劑+0.7 g干燥硅膠;(2)1包Wonderkeep RP-100脫氧劑+0.7 g干燥硅膠+1 g種子(30%相對濕度);(3)1包Wonderkeep RP-100脫氧劑+0.7 g干燥硅膠+1 g種子(30%相對濕度)+20 g 30%相對濕度下平衡的硅膠,將上述3個處理分別加入194 mL貯藏瓶中,密閉。0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h后分別測定玻璃瓶中氧氣含量,3 d后結束試驗,記錄相對濕度和溫度變化情況。

2 結果與分析

2.1 充氮氣

經過120 s充氮氣后,所有處理的玻璃瓶中氧氣含量為0(圖1)。3 d后,種子水活度較充氮氣前下降0.01—0.03,表明充高壓氮氣對種子樣品有干燥作用。

圖1 充氮氣時間對裝有不同數量種子的玻璃瓶中氧氣含量的影響Fig.1 Effect of flushing time with nitrogen gas on oxygen levels in glass jars containing different amount of seeds

2.2 抽真空

抽真空處理不改變種子的水活度,但不能完全去除包裝中氧氣,這可能是由于種子間存在間隙所致。

2.3 4種脫氧劑去氧效果

圖2 加入4種脫氧劑后密閉的玻璃瓶中氧氣含量和相對濕度變化Fig.2 Evolution of oxygen levels and relative humidity in closed glass jars with 4 different oxygen absorbers

未加入脫氧劑的玻璃瓶,氧氣含量幾乎不變(圖2A)。加入脫氧劑Ageless FX-50L 4 d后,玻璃瓶中氧氣含量僅降低了5.9%,之后幾乎不再下降。加入Ageless ZPT-50MBC和Wonderkeep RP-100 24 h后玻璃瓶中氧氣含量為0。加入Ageless Z-50PKC 50 h后玻璃瓶中的氧氣含量為0。這3種脫氧劑(包含增濕劑)都能有效去除玻璃瓶中氧氣,但同時,玻璃瓶中相對濕度大幅增加。含有Ageless FX-50L脫氧劑的玻璃瓶中相對濕度變化不大(圖2B)。

圖3 硅膠水活度和水分含量對應關系Fig.3 Relationship between water activity and moisture content of silica gel samples

2.4 Wonderkeep RP-100脫氧劑釋放水份的去除

加入脫氧劑后,要保持種子aw不變,需要去除脫氧劑吸收氧氣過程中釋放的水份。經測定,每包Wonderkeep RP-100脫氧劑去除氧氣過程中釋放的水份量為126 mg(n=5,SE=3 mg)。

根據貯藏中種子所需達到的的目標aw計算吸收脫氧劑釋放的水分所需干燥硅膠的量。當種子aw<0.4時,硅膠吸附和解析曲線一致。而當種子0.4

2.5 Wonderkeep RP-100脫氧劑和硅膠去氧系統測試

將脫氧劑、硅膠、種子和溫濕度儀按1.4.4方法加入194 mL貯藏瓶中后密閉,24 h后,貯藏瓶中氧氣含量均為0,干燥硅膠的加入不影響脫氧劑去除氧氣(圖4A)。脫氧劑+干燥硅膠以及脫氧劑+干燥硅膠+種子兩個處理,貯藏瓶中的相對濕度開始時下降,之后緩慢增加。20 g緩沖硅膠的加入使貯藏瓶中相對濕度保持穩定(圖4B)。加入脫氧劑的貯藏瓶中溫度基本保持在20℃(圖4C)。

圖4 加入Wonderkeep RP-100脫氧劑后密閉玻璃瓶中氧氣含量、相對濕度和溫度變化Fig.4 Oxygen depletion,evolution of the RH and temperature in closed glass jars with a Wonderkeep RP-100 oxygen absorber

3 討論與結論

充氮氣可以完全去除貯藏容器內氧氣,其優點是可以監測貯藏瓶中氧氣濃度,通過控制通氣時間長短建立不同氧氣含量的貯藏環境。其缺點是會干燥種子,尤其對少量種子的貯藏有影響,但添加足量的平衡硅膠可使種子aw保持不變。鋁箔袋真空包裝節省勞力和空間,且不影響種子aw,但是不能完全去除包裝內的所有氧氣。殘留氧氣的量,取決于設備的真空度以及種子之間空隙,殘留的氧氣最終會被種子緩慢吸收[13]。但由于鋁箔袋是不透明的,氧氣吸收速率無法監測。

選擇適合的脫氧劑可以快速建立無氧貯藏環境。本研究發現,3種含增濕劑的脫氧劑去除氧氣后增加了種子水活度。這與食品工業中推薦的當環境中RH低于75%時,使用脫氧劑需要加入增濕劑一致[17]。

沸石干燥珠和干燥硅膠都可以作為干燥劑[18-19]。僅使用脫氧劑和少量干燥劑無法建立一個精準的RH調節系統,本研究在貯藏容器內同時加入干燥硅膠和平衡硅膠,干燥硅膠用于吸收脫氧劑去除氧氣過程中釋放的水份;一定相對濕度下平衡的硅膠能使一定空間內的相對濕度保持相對恒定。如果容器中加入足量的平衡硅膠,可起到調節貯藏環境中相對濕度的作用。

使用含增濕劑的鐵粉脫氧劑或充氮氣可快速有效地創建種子無氧貯藏環境,通過添加一定數量的干燥硅膠吸收脫氧劑釋放的水分可保持期望的種子水活度。針對少量種子的貯藏,可以添加足量平衡硅膠來調節種子aw。應用脫氧劑和充氮氣對不同作物種子貯藏性能的影響有待進一步研究。