免疫磁珠-高效液相色譜法測定虎杖中抑制前白蛋白轉化酶枯草菌素9成分含量

劉興艷，涂家潔，朱承華，趙佳菲，張曉芝

（寧波職業技術學院 化學工程學院，浙江寧波 315800）

虎杖為蓼科蓼屬植物虎杖的干燥根莖和根?；⒄戎饕祯?、黃酮類、芪類及酚類等的化合物，具有多種藥理活性，包括抗菌、抗炎、抗病毒、降血脂、抗氧化、改善心血管等。其中黃酮類、二苯乙烯類及蒽醌類具有顯著的降脂作用，被認為是虎杖中降脂作用有效組分[1]。

PCSK9是一個脂質調節蛋白。PCSK9是當前最熱的降脂靶點之一，在高脂血癥、糖尿病及心血管疾病等中有著重要作用。研究發現家族遺傳性高膽固醇血癥發生的重要原因之一是PCSK9突變基因[2]。同時，在動物實驗揭示了PCSK9在調節膽固醇水平上的作用，PCSK9與常染色體顯性家族性高膽固醇血癥有關的基因。

本文以降脂相關中藥虎杖為研究對象，利用PCSK9磁珠親和結合HPLC技術快速特異檢測抑制PCSK9成分，為尋找PCSK9直接作用成分的篩選提供方法參考，同時對虎杖藥效物質基礎研究有一定推動作用。

1 實驗部分

1.1 藥品與試劑

虎杖（寧波中醫院門診部）；Tris-base（Sigma公司）；咪唑（美侖生物）

1.2 設備

高效液相色譜儀（美國 安捷倫）；超聲細胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限股份有限公司）；凝膠成像（BIO-RAD）；電子天平（德國Sartouris）。

1.3 試劑配制

（1）Wash Buffer：20mmol/L Na3PO4，500mmol/L NaCl，0～40mmol/L Imidazole，pH 7.4。

（2）Elution Buffer：20mmol/L Na3PO4，500mmol/L NaCl、400mmol/L Imidazole，pH 7.4。

（3）100mmol/L PBS：稱取2.964g NaH2PO4·2H2O，85g NaCl，30g Na2HPO4·12H2O，雙蒸水H2O定容至1L，調pH為 7.4。其他離子強度的PBS溶液按比例稀釋即可。

（4）SBC-115076溶液：取適量SBC-115076，以DMSO配成100mmol/L溶液，即得。

2 實驗方法

2.1 條件優化

（1）孵育時間考察。PCSK9磁珠于離心管中（加入1mL，PBS重懸，重復操作一次。磁性分離，加入含1μL SBC-115076溶液，PBS溶液 1mL，將離心管放置于旋轉混合儀上，室溫分別旋轉孵育5min、10min、15min及20min，考察不同孵育時間下陽性藥的吸附量。分離后棄上清液。加入PBS 500μL，反復顛倒離心管1min使磁珠重懸，磁性分離，保留磁珠，棄上清液。重復清洗一次。每個離心管中加入200μL Elution Buffer，充分混勻磁珠，置于旋轉混合儀上旋轉洗脫10min。磁性分離，收集洗脫液，第二次洗脫，合并兩次的洗脫液。氮吹吹干，加入100μL甲醇超聲溶解，濾過，得樣品。

對照組是空載磁珠與SBC-115076結合。HPLC檢測SBC-115076的吸附量，通過對比確定最適孵育時間。

（2）分別在4 ℃、10 ℃、25 ℃及37 ℃孵育，考察不同溫度的影響。

2.2 液相色譜條件

Agilent 1260 HPLC 色譜系統，選擇SB-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）。流動相由0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）組成，梯度洗脫：0～15min，15%～90% B，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。

2.3 數據處理與分析

實驗結果采用Mean±SD表示，采用Student-t檢驗，p＜0.05表示有統計學意義上的差異，p＜0.01表示顯著性差異。制圖由 Graphpad prism 7 軟件進行。

3 結果

3.1 孵育時間對PCSK9抑制劑SBC-115076與磁珠結合的影響

隨著時間的延長，結合率逐步提升，并在15min達到最高蛋白載量（圖1）。而后，隨著時間繼續延長，蛋白載量呈降低趨勢。在長時間的孵育過程中，蛋白有失活或非特異結合的風險，最終導致蛋白結合率下降。因此選擇合適的孵育時間對蛋白結合很重要，本實驗選取15min為結合孵育時間。

圖1 孵育時間對SBC-115076與磁珠結合的影響

3.2 孵育溫度對PCSK9抑制劑SBC-115076與磁珠結合的影響

隨著溫度的升高，分子熱運動加快，有利于分子間的碰撞和相互作用。如圖2所示，隨著溫度的升高，PCSK9抑制劑SBC-115076與磁珠的結合率逐步上升，在25 ℃下孵育時達到最大。而后隨著溫度的提升，結合率下降。高溫在增加分子熱運動的同時，亦會促使蛋白構象變化，致使活性喪失。而且過劇的分子熱運動，亦會使已結合的PCSK9磁珠再次斷裂。因此選擇合適的孵育溫度對蛋白結合很重要，本實驗選取25℃為孵育溫度。

圖2 孵育溫度對SBC-115076與磁珠結合的影響

3.3 樣品提取液的優化

提取溶液有甲醇-水系統、乙醇-水系統和乙腈-水系統，比較甲醇、乙醇和乙腈（90%、70%、50%）的提取效果。將虎杖與磁珠孵育考察加標樣回收率，當提取稀釋液中乙腈含量達到70%時，加標回收率下降到48.09%。為保證抗體不被破壞，選取70%乙醇作為提取液（圖3）。

圖3 提取液對虎杖樣品加標的影響

3.4 辨識虎杖中抑制PCSK9成分

由圖4可知，在280nm波長下，圖4（a）圖與圖4（b）比較，保留時間14.4min峰面積明顯較高，排除親和過程中引入的雜質影響，經過質譜鑒定峰為虎杖苷，是潛在PCSK9抑制劑。

圖4 PCSK9磁珠垂釣虎杖中親和成分HPLC對比圖譜

3.5 含量測定

3.5.1 分析條件的確定

通過HPLC對待分析樣品進行基本分離，綜合考慮分離時間及分離效果，最終選擇水/乙腈流動相系統，因所需篩選藥材較多，本部分未對其具體流動相比例進行逐一優化，選取統一的梯度洗脫系統，分別在203nm、254nm、280nm、320nm 下進行檢測，以綜合涵蓋虎杖中各類成分。因203nm下檢測雜質干擾較大，且本實驗所選流動相中含有0.1%甲酸，在末端吸收203nm下會導致基線漂移，影響后續分析，故此部分主要比對其他波長下的峰差異，確定親和成分。

3.5.2 標準曲線、線性范圍和檢出限

在色譜條件下，對六個不同濃度的標準溶液經行測定，峰的峰面積為縱坐標（Y），相對應的質量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，并根據信噪比（S/N）確定檢出限和定量限。虎杖苷在線性范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=378.4X-43.2，相關系數為0.999，檢出限為23.1μg/kg，定量限為231.5μg/kg。

3.5.3 準確度和精密度

加入低、中、高三個濃度水平的虎杖苷標準溶液，按照優化的磁珠方法進行孵育，結合高效液相色譜法測定虎杖苷含量，每個加標水平平行測定6次，計算3個濃度水平下虎杖苷的加標回收率和相對標準偏差，結果在3個濃度水平下虎杖苷平均回收率為95.78%～102.51%，相對標準偏差1.4%～3.5%，小于5.0 %，說明該方法可靠，精密度良好，符合高效液相色譜法快速測定的要求。

3.5.4 日間精密度考察

連續5d的加標回收率在 101.63%～103.01%，日間精密度在 4.88%～5.72%，重現性良好（表1）。

表1 虎杖磁珠-高效液相色譜的加標回收率和RSD

4 討論

磁珠親和法可將靶標固定于磁珠上，進而從混合物中有效地結合并分離相應配體，具有簡便快捷、特異性高的優點。運用此方法，已成功篩選出多種靶標的中藥特異親和成分藥物在體內可與其靶點結合，改變靶點的相應生理功能，進而達到治療效果。本研究基于免疫磁珠結合高效液相色譜法分析，建立了一種篩選PCSK9富集含量檢測方法。以PCSK9抑制劑SBC-115076為工具藥，對其與PCSK9磁珠的結合關鍵影響因素（孵育溫度和孵育時間）進行了優選。最終優選PCSK9磁珠親和條件為：磁珠與藥物共孵育15min，孵育溫度25℃。PCSK9調節LDL-C水平受基因位點突變的影響，通過兩種方法突變，其一是增強PCSK9上調LDL-C的能力，導致高膽固醇血癥的功能獲得型突變，第二是降低或取消PCSK9上調LDLC的能力，導致低膽固醇血癥的功能缺失型突變[3-4]。諸多中藥，如銀杏葉、紅花、何首烏、懷牛膝、虎杖、澤瀉等均表現出較好的降脂作用，多年臨床，安全性佳。近年關于中藥與PCSK9的相互作用的研究發現中藥，單體成分包括虎杖苷[5]、姜黃素[6]、小檗堿[7]和丹參酮IIA[8]等或藥用部位都對PCSK9蛋白轉錄或表達水平有抑制作用。同時，中藥或其單體成分在整體水平上亦展現出對血漿中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及PCSK9水平異常的改善作用。中藥成分復雜，虎杖藥理活性廣泛。本研究選擇虎杖這一具有降脂活性的常用中藥進行PCSK9磁珠親和選擇，結合HPLC含量測定，快速檢測出虎杖中抑制PCSK9成分虎杖苷，進一步明確了虎杖苷與PCSK9的親和作用，為天然產物虎杖苷的創新開發提供了實驗基礎。