咪唑安定通過調控miR-4458/NF-κB通路影響結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲

劉愛芬 王輝 王曉鵬天津醫科大學第二醫院麻醉科 00；天津市公安醫院外一科 0004；山西白求恩醫院麻醉科，太原 000

世界衛生組織最新癌癥統計數據顯示，每年全球結腸癌死亡病例高達86萬例，已成為全球第3大常見惡性腫瘤［1］。手術切除是結腸癌最有效的治療手段，然而越來越多臨床或基礎研究表明圍術期麻醉技術對殘留腫瘤細胞存活和轉移的影響是導致癌癥復發或術后轉移的重要因素［2］。因此，尋找有效的抗癌麻醉藥對改善結腸癌患者預后、提高生存率具有重要意義。咪達唑侖是一種廣泛使用的苯二氮卓類麻醉劑，具有麻醉前給藥、誘導和維持麻醉、治療失眠和癲癇、重癥監護室鎮靜等多種用途。近年來研究發現，咪唑安定對肝癌、咽鱗癌細胞具有顯著細胞毒性作用［3-4］。咪 唑 安 定 通 過 上 調 微 小RNA（microRNA，miR）-137表達還可抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡［5］。有報道指出，咪達唑侖可激活線粒體凋亡途徑，誘導結腸癌細胞凋亡，抑制異種移植瘤生長［6］。miR-4458是一種新的抑癌基因，結腸癌中miR-4458下調，過表達miR-4458可抑制癌細胞增殖、糖酵解和乳酸生成［7］。有研究指出，異丙酚通過上調miR-4458表達對肝細胞進展具有抑制作用［8］。然而，咪達唑侖對結腸癌細胞遷移和侵襲的影響，其機制是否與調控miR-4458表達相關并不清楚。本研究于2019年12月至2020年10月開展實驗，通過體外實驗分析咪唑安定對結腸癌SW620細胞增殖、遷移、侵襲以及miR-4458表達的影響，并進一步揭示其潛在機制。

1 資料與方法

1.1 細胞和試劑 人結腸癌細胞SW620購于中國典型培養物保藏中心；咪唑安定（純度為98%）購于中國上海士鋒生物公司；miR-4458抑制物（anti-miR-4458）及其陰性對照（anti-miR-NC）由中國廣州銳博公司合成；miR檢測試劑盒購于美國Gene Copoeia公司；Transwell小室購于中國南京迅貝生物科技有限公司；核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrrolidinedithiocarbamic acid ammonium salt，PDTC）、噻唑藍（Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT）試劑盒、兔源細胞周期 素D1（CyclinD1）、基 質 金 屬 蛋 白 酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、MMP9多克隆抗體購于中國北京百奧萊博公司；兔源磷酸化的核因子κB p65（phosphorylated nuclear factor kappa Bp65，p-p65）抗體、β激動蛋白（beta-actin，β-actin）單克隆抗體、羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗購于美國CST公司；鼠源磷酸化的NF-κB抑制蛋白（phosphorylated inhibitor of NF-κB，p-IкBα）單克隆抗體購于美國SCBT公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、處理和分組 SW620細胞用含有20.0%胎牛血清的杜爾伯格伊戈爾培養基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）置于37℃恒溫、5.0%CO2培養箱中培養。為檢測咪唑安定對SW620細胞生物學行為的影響，分別用含0、25、50、100μM咪唑安定［3］的培養液孵育SW620細胞48 h，依次記為0μM咪唑安定組、25μM咪唑安定組、50μM咪唑安定組、100μM咪唑安定組。為證實咪唑安定的抗腫瘤作用與調控miR-4458表達有關，利用脂質體轉染法分別將anti-miR-4458、anti-miR-NC轉染SW620細胞。將轉染anti-miR-4458、anti-miR-NC后48 h的SW620細胞分別記為anti-miR-4458組、anti-miR-NC組。用含100μM咪唑安定培養液孵育轉染細胞48 h，分為anti-miR-4458+100μM咪唑安定組、anti-miR-NC+100μM咪唑安定組。為證實NF-κB通路的作用，用終濃度為20 pmol/L的PDTC［9］和100μM咪唑安定干預轉染anti-miR-4458細胞48 h，記為PDTC+anti-miR-4458+100μM咪唑安定組。按照下述具體步驟檢測miR-4458表達以及細胞增殖、遷移、侵襲能力。

1.2.2 實時定量聚合酶鏈反應檢測miR-4458表達使用miR提取試劑盒從上述各組細胞中分離miR，采用miR檢測試劑盒進行逆轉錄和定量檢測。miR-4458正向引物5'-AGAGGTAGGTGTGGAAGAA-3'， 反 向 引 物5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3；U6正 向 引 物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'， 反 向 引 物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。2-△△Ct方 法 分 析SW620細胞中miR-4458表達水平。

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色（MTT）法檢測細胞活力 每組取5×103個SW620細胞接種到96孔板，向各孔內加入20μl MTT工作液孵育細胞2 h，然后每孔添加150μl二甲基亞砜反應2 h，震蕩10 min至結晶溶液。用分光光度儀在570 nm處測定各孔的吸光度（A值）以表示細胞增殖活力。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 每組取1×105個SW620細胞接種于涂有（侵襲測定）或未涂有（遷移測定）基質凝膠的上腔室中，培養基為200μl無血清培養基。下腔室中為600μl含10.0%胎牛血清的培養基。培養24 h后，采用4.0%多聚甲醛固定膜下表面細胞，0.2%結晶紫染色。用倒置顯微鏡觀察200×鏡下細胞，以隨機5個視野細胞數的均值表示細胞遷移或侵襲能力。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測CyclinD1、MMP2、MMP9、p-p65和p-IкBα蛋白表達 用RIPA裂解液從不同組SW620細胞中提取總蛋白。用10.0%SDS-PAGE分離30μg蛋白樣品，并濕法轉移到聚偏二氟乙烯膜上。膜封閉后，將 膜 與CyclinD1（1∶300）、MMP2（1∶1 000）、MMP9（1∶300）、p-p65（1∶1 000）、p-IкBα（200μg/ml）、β-actin抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜。然后，用羊抗兔IgG二抗孵育膜2 h。用增強化學發光系統對X線片進行顯影、定影。凝膠圖象處理系統分析目的條帶的凈灰度值（β-actin為內參）。

1.3 統計學分析 采用SPSS 18.0.0進行統計分析。符合正態分布的實驗數據采用均數±標準差（）表示。用單因素方差分析和LSD-t檢驗評估多組間差異；用獨立樣本t檢驗評估兩組間差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度咪唑安定對SW620細胞增殖、CyclinD1的抑制作用 與0μM咪唑安定組比較，25μM咪唑安定組、50μM咪唑安定組、100μM咪唑安定組SW620細胞增殖活力、CyclinD1蛋白表達量顯著降低（均P＜0.05）。隨著咪唑安定濃度的增加，其對SW620細胞增殖活力、CyclinD1蛋白表達的抑制作用逐漸增強。見圖1和表1。

表1 不同濃度咪唑安定對SW620細胞增殖、細胞周期素D1的抑制作用（n=9）

表1 不同濃度咪唑安定對SW620細胞增殖、細胞周期素D1的抑制作用（n=9）

注：與0μM咪唑安定組比較，a P＜0.05

組別0μM咪唑安定組25μM咪唑安定組50μM咪唑安定組100μM咪唑安定組F值P值A值1.089±0.07 0.843±0.05a 0.611±0.04a 0.527±0.03a 231.994＜0.001細胞周期素D1 0.83±0.07 0.70±0.05a 0.51±0.03a 0.44±0.03a 123.913＜0.001

圖1 蛋白質印跡法檢測CyclinD1蛋白相對表達量

2.2 不同濃度咪唑安定對SW620細胞遷移和侵襲能力、MMP2、MMP9的抑制作用 與0μM咪唑安定組比較，25μM咪唑安定組、50μM咪唑安定組、100μM咪唑安定組SW620細胞遷移和侵襲數量、MMP2和MMP9蛋白表達量顯著降低（均P＜0.05）。隨著咪唑安定濃度的增加，其對SW620細胞遷移、侵襲、MMP2和MMP9蛋白表達的抑制作用逐漸增強。見圖2和表2。

表2 不同濃度咪唑安定對SW620細胞遷移和侵襲的、MMP2、MMP9抑制作用（n=9，）

表2 不同濃度咪唑安定對SW620細胞遷移和侵襲的、MMP2、MMP9抑制作用（n=9，）

注：與0μM咪唑安定組比較，a P＜0.05；MMP2為基質金屬蛋白酶2，MMP9基質金屬蛋白酶

組別0μM咪唑安定組25μM咪唑安定組50μM咪唑安定組100μM咪唑安定組F值P值細胞遷移數量179±13.07 147±10.49a 117±8.06a 83±6.13a 158.339＜0.001細胞侵襲數量136±9.14 113±8.67a 89±4.71a 61±3.79a 190.933＜0.001 MMP2 0.91±0.07 0.73±0.05a 0.56±0.04a 0.45±0.03a 147.242＜0.001 MMP9 0.76±0.06 0.58±0.04a 0.41±0.03a 0.34±0.02a 195.092＜0.001

圖2 蛋白質印跡法檢測MMP2、MMP9蛋白相對表達量

2.3 不同濃度咪唑安定對miR-4458、p-p65、p-IкBα表達的影響 與0μM咪唑安定組比較，25μM咪唑安定組、50μM咪唑安定組、100μM咪唑安定組SW620細胞miR-4458表達量顯著升高（均P＜0.05），p-p65和p-IкBα蛋白表達量顯著降低（均P＜0.05）。隨著咪唑安定濃度的增加，其對SW620細胞miR-4458、p-p65和p-IкBα蛋白表達的抑制作用逐漸增強。見圖3和表3。

圖3 蛋白質印跡法檢測p-p65、p-IкBα蛋白相對表達

表3 不同濃度咪唑安定對miR-4458、p-p65、p-IкBα表達的影響（n=9，）

表3 不同濃度咪唑安定對miR-4458、p-p65、p-IкBα表達的影響（n=9，）

注：與0μM咪唑安定組比較，a P＜0.05；p-p65為核因子κB p65，p-IкBα為NF-κB抑制蛋白

組別0μM咪唑安定組25μM咪唑安定組50μM咪唑安定組100μM咪唑安定組F值P值miR-4458 1.00±0.08 1.43±0.10a 1.89±0.15a 2.01±0.14a 131.256＜0.001 p-p65 0.83±0.07 0.70±0.05a 0.57±0.04a 0.43±0.03a 107.242＜0.001 p-IкBα 0.71±0.05 0.61±0.04a 0.48±0.04a 0.37±0.02a 130.377＜0.001

2.4 抑制miR-4458表達可以減輕咪唑安定對結腸癌細胞miR-4458、增殖、遷移、侵襲、CyclinD1、MMP2、MMP9的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-4458組SW620細胞增殖活力、遷移和侵襲數量、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達量顯著升高（均P＜0.05）；與anti-miR-NC+100μM咪唑安定組比較，anti-miR-4458+100μM咪唑安定組SW620細胞增殖活力、遷移和侵襲數量、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達量顯著升高（均P＜0.05）。見圖4和表4。

表4 抑制miR-4458表達可以逆轉咪唑安定對結腸癌細胞miR-4458、增殖、遷移、侵襲、CyclinD1、MMP2、MMP9的影響（n=9）

表4 抑制miR-4458表達可以逆轉咪唑安定對結腸癌細胞miR-4458、增殖、遷移、侵襲、CyclinD1、MMP2、MMP9的影響（n=9）

注：與anti-miR-NC組比較，aP＜0.05；與anti-miR-NC+100μM咪唑安定組比較，bP＜0.05；CyclinD1為細胞周期素D1，MMP2為基質金屬蛋白酶2，MMP9為基質金屬蛋白酶9

組別anti-miR-NC組anti-miR-4458組anti-miR-NC+100μM咪唑安定組anti-miR-4458+100μM咪唑安定組F值P值miR-4458 1.00±0.08 0.48±0.03a 1.98±0.13 1.21±0.09b 431.954＜0.001 A值1.093±0.08 1.428±0.11a 0.534±0.04 0.978±0.07b 196.416＜0.001細胞遷移數量183±14.55 237±19.76a 87±5.73 173±9.84b 189.490＜0.001細胞侵襲數量131±8.14 179±14.12a 65±4.13 143±11.04b 201.546＜0.001 CyclinD1 0.85±0.06 1.37±0.11a 0.43±0.02 0.81±0.06b 272.589＜0.001 MMP2 0.93±0.08 1.58±0.12a 0.48±0.03 0.89±0.08b 264.854＜0.001 MMP9 0.77±0.06 1.11±0.09a 0.36±0.02 0.75±0.05b 231.842＜0.001

圖4 蛋白質印跡法檢測CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達

2.5 NF-κB抑制劑PDTC可逆轉抑制miR-4458對咪唑安定處理的SW620細胞p-p65、p-IкBα、增殖、遷移、侵襲、CyclinD1、MMP2和MMP9的影響 與anti-miR-4458+100μM咪唑安定組比較，PDTC+anti-miR-4458+100μM咪唑安定組SW620細胞p-p65、p-IкBα、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達量顯著降低（均P＜0.05），細胞增殖活力、遷移和侵襲數量顯著降低（均P＜0.05）。見圖5和表5。

表5 PDTC可以逆轉miR-4458下調對咪唑安定處理的SW620細胞p-p65、p-IкBα、增殖、遷移、侵襲、CyclinD1、MMP2、MMP9的影響（n=9）

表5 PDTC可以逆轉miR-4458下調對咪唑安定處理的SW620細胞p-p65、p-IкBα、增殖、遷移、侵襲、CyclinD1、MMP2、MMP9的影響（n=9）

注：p-p65為核因子κB p65，p-IкBα為NF-κB抑制蛋白，CyclinD1為細胞周期素D1，MMP2為基質金屬蛋白酶2，MMP9為基質金屬蛋白酶9

組別anti-miR-4458+100μM咪唑安定組PDTC+anti-miR-4458+100μM咪唑安定組t值P值p-p65 0.91±0.07 0.48±0.03 16.939＜0.001 p-IкBα 0.73±0.05 0.34±0.04 18.272＜0.001 A值0.978±0.07 0.547±0.03 16.978＜0.001細胞遷移數量173±9.84 76±4.19 27.209＜0.001細胞侵襲數量143±11.04 61±4.05 20.919＜0.001 CyclinD1 0.81±0.06 0.43±0.03 16.994＜0.001 MMP2 0.89±0.08 0.46±0.03 15.098＜0.001 MMP9 0.75±0.05 0.39±0.02 20.055＜0.001

圖5 蛋 白 質 印 跡 法 檢 測p-p65、p-IкBα、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達

3 討 論

近年來研究表明，麻醉可能會影響患者代謝，加劇圍術期免疫抑制和炎癥，與癌細胞轉移、擴散以及腫瘤復發相關［2］。本研究探討了咪唑安定對結腸癌細胞惡性生物學行為的影響，結果顯示咪唑安定可降低SW620細胞增殖活力，下調促增殖蛋白CyclinD1表達，與竇云凌等［10］報道的抗增殖作用相吻合。結腸癌的侵襲和轉移是一個復雜、連續的多步驟過程，其中細胞外基質（extracellular matrix，ECM）降解是腫瘤轉移的重要事件［11］。MMP2和MMP9是MMP蛋白家族成員，可降解膠原蛋白和ECM各種成分，MMP2和MMP9表達改變與結腸癌轉移密切相關［12］。本研究表明，咪唑安定處理可下調MMP2和MMP9表達，降低SW620細胞遷移和侵襲能力。此外，本研究發現，咪唑安定濃度越高，其對SW620細胞增殖、遷移和侵襲以及CyclinD1、MMP2和MMP9表達抑制作用越強，這表明咪唑安定對結腸癌細胞惡性生物學行為具有抑制作用。與此發現一致，洪金全等［13］證實，咪唑安定以劑量依賴方式抑制套細胞淋巴瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡。

miR作為基因表達的關鍵調節因子，可影響腫瘤發生和進展。研究表明，miR-4458在乳腺癌組織、細胞中表達顯著降低，miR-4458下調增強了乳腺癌細胞的增殖活力、遷移和侵襲能力［14］。miR-4458可抑制肺癌細胞遷移和上皮-間充質轉化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）進程［15］。敲減細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2B反義RNA1對骨肉瘤細胞增殖、遷移和EMT進展的抑制作用與誘導miR-4458表達有關［16］。本研究發現，咪唑安定可增加SW620細胞中miR-4458表達量，暗示咪唑安定的抗腫瘤作用可能與調控miR-4458表達有關。功能實驗表明，轉染anti-miR-4458抑制miR-4458表達可增加SW620細胞增殖活力、遷移和侵襲能力，上調CyclinD1、MMP2和MMP9表達，并逆轉咪唑安定對SW620增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

NF-κB是一種普遍存在的核轉錄因子，由p50、p65和IκBα亞基組成，其激活參與細胞增殖、炎癥、血管生成和轉移，是結腸癌治療的重要靶點［17］。有研究表明，姜黃素通過激活腺苷酸活化蛋白激酶和抑制NF-κB活化可抑制MMP9表達進而抑制結腸癌細胞侵襲［18］。姜黃素通過抑制NF-κB活化可逆轉結腸癌細胞EMT進程和遷移［19］。此外，咪唑安定聯合舒芬太尼通過抑制NF-κB的表達可抑制炎性反應，提高鎮靜、鎮痛效果，減輕急性胰腺炎損傷［20］。本研究表明，咪唑安定處理可抑制p-p65、p-IкBα表達，抑制NF-κB活化。深入研究表明，使用PDTC抑制NF-κB顯著減弱抑制miR-4458聯合咪唑安定對SW620增殖、遷移和侵襲的影響，這說明miR-4458/NF-κB途徑是咪唑安定在結腸癌中發揮抗腫瘤作用的重要途徑。

總之，本研究證實，咪唑安定對結腸癌細胞增殖活力、遷移和侵襲能力具有抑制作用，其機制是通過上調miR-4458表達、抑制NF-κB活化實現的，這進一步揭示了咪唑安定的抗腫瘤機制，為咪唑安定用于防治結腸癌提供重要依據。

利益沖突：文章所有作者共同認可文章無相關利益沖突。