基于Ras/ERK信號(hào)通路益腎通癃湯對(duì)人前列腺癌 PC-3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響

劉德果，李姿蓉，陳其華，趙姣，楊磊，李博，向時(shí)竹，林夢(mèng)姣

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410207； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410008

前列腺癌早期癥狀相對(duì)隱匿，缺少特征性臨床表現(xiàn)，多數(shù)被確診的患者已是腫瘤中晚期階段，失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，只能采用內(nèi)分泌及化療手段治療。前列腺癌發(fā)病機(jī)制至今仍未完全明確，前列腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)過程受到諸多基因的調(diào)控與影響[1]。因此，研究相關(guān)基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞生物學(xué)過程的作用機(jī)制將給本病的防治提供確切有效的治療靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，Ras/ERK信號(hào)通路是調(diào)控前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)過程的關(guān)鍵通路[2]。Semenchenko等[3]研究表明，在前列腺癌組織中Ras致癌突變表達(dá)水平較正常前列腺組織顯著升高，且Ras致癌突變高表達(dá)患者更易于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。臨床及基礎(chǔ)研究表明，中醫(yī)藥在改善前列腺癌具體臨床癥狀、延緩內(nèi)分泌耐受、改善生活質(zhì)量、調(diào)護(hù)心理健康等方面有較好的療效[4-5]。益腎通癃湯是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療前列腺癌的經(jīng)驗(yàn)方，近20年臨床應(yīng)用表明，其能明顯緩解前列腺癌患者排尿困難、食欲減低、乏力等臨床癥狀，明顯提高患者生活質(zhì)量，降低炎性相關(guān)指標(biāo)水平，并對(duì)化療藥物起到減毒增效的作用[6]，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。本研究以人前列腺癌PC-3細(xì)胞為研究對(duì)象，從Ras/ERK信號(hào)通路調(diào)控角度探討益腎通癃湯對(duì)PC-3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

人前列腺癌PC-3細(xì)胞株，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)（目錄號(hào)TCHu158）。

1.2 動(dòng)物

選取SPF級(jí)雄性SD大鼠30只進(jìn)行藥物血清制備，體質(zhì)量180～220g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（湘）2019-0009，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度21～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，每日按時(shí)喂養(yǎng)。

1.3 藥物

益腎通癃湯（補(bǔ)骨脂15g，熟地黃15g，黃芪30g，三棱10g，莪術(shù)10 g），飲片購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，均為超微中藥，本院制劑室根據(jù)臨床等效劑量[7]水煎濃縮后制成膏劑，其終濃度為含原藥材1.44 g/mL，置于無菌棕色瓶，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要試劑與儀器

RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司，批號(hào)8120357；胎牛血清，美國(guó)Gibco公司，批號(hào)42G3099K；CCK-8試劑盒，日本Dojindo公司，批號(hào)JP198233；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，日本Dojindo公司，批號(hào)VN833；RIPA裂解液，美國(guó)賽默飛世爾公司，批號(hào)33454712；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，美國(guó)賽默飛世爾公司，批號(hào)YP195441；溴化乙錠，美國(guó)賽默飛世爾公司，批號(hào)CC3348574；RNase A，美國(guó)賽默飛世爾公司，批號(hào)LD45845；PVDF膜，Millipore公司，批號(hào)K8A4571；鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Snail）、Ras、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）、p-ERK1/2、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）抗體，美國(guó)賽默飛世爾公司，貨號(hào)分別為10H8L11、Thr185、5AD13MA、6D2、CDH1、8C11、IIA5。超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)SW-CJ-2FD），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Panasonic公司，型號(hào)MCO-20AIC），酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司，型號(hào)SpectraMax i3），電子顯微鏡（日本Olympus公司，型號(hào)TH4-200），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司，型號(hào)LSRⅡ）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物血清制備

實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白血清組和藥物血清組。將益腎通癃湯膏劑加入蒸餾水，益腎通癃湯膏低（0.36 g/mL）、中（0.72 g/mL）、高劑量（1.44 g/mL）組予相應(yīng)劑量藥液灌胃，空白血清組大鼠予等體積生理鹽水灌胃。早晚各1次，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h，離心，過濾，滅活，吸取上清液，即為藥物血清或空白血清。同時(shí)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，PC-3細(xì)胞最大耐受劑量為14.5 g/（mL?d），故本研究給藥劑量并未影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

PC-3細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)48～72 h，0.25%胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將PC-3細(xì)胞分為空白血清組、益腎通癃湯含藥血清高、中、低劑量組（益腎通癃湯高、中、低劑量組），空白血清組予空白血清干預(yù)，益腎通癃湯高、中、低劑量組分別予高、中、低劑量益腎通癃湯含藥血清干預(yù)。48 h后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，細(xì)胞抑制率檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為24 h及48 h。

2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

采用CCK8法檢測(cè)PC-3細(xì)胞增殖，計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）＝（1－實(shí)驗(yàn)組吸光度值÷對(duì)照組吸光度值）×100%。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集PC-3細(xì)胞，洗滌后以標(biāo)記液重懸細(xì)胞，25 ℃避光孵育15 min。1500r/min離心15 min，取細(xì)胞沉淀加熒光（SA-Flous）溶液，低溫孵育15 min。按照標(biāo)準(zhǔn)程序使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用ModFit LT軟件進(jìn)行處理。

2.5 細(xì)胞侵襲、遷移檢測(cè)

采用Transwell小室法檢測(cè)PC-3細(xì)胞侵襲及遷移。制備Transwell小室，加基礎(chǔ)培養(yǎng)基及Matergel，37 ℃水化基底膜。將PC-3細(xì)胞制成密度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，吸取適量懸液加至上室，下室加含10%FBS完全培養(yǎng)基，避光孵育24 h；洗凈后用甲醇固定30 min，0.5%結(jié)晶紫染色5 min，鏡下觀察并拍照。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)同侵襲實(shí)驗(yàn)，無Matergel包被步驟。

2.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

提取PC-3細(xì)胞蛋白，高速離心15 min，吸取上清液，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，加5%胎牛血清白蛋白，37 ℃封閉1.5 h，洗膜后加Snail、Ras、p-ERK1/2、ERK1/2、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9一抗，4 ℃孵育過夜。次日加二抗37 ℃孵育1.5 h，顯影，結(jié)果運(yùn)用Image Lab軟件進(jìn)行處理，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)量。

2.7 RT-PCR檢測(cè)相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)

收集PC-3細(xì)胞，提取總RNA，并測(cè)定其濃度，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。經(jīng)濃度及純度檢測(cè)后，根據(jù)試劑盒說明書合成cDNA，并以β-actin為內(nèi)參，SYBR Green PCR試劑盒擴(kuò)增Ras、ERK1、E-cadherin、N-cadherin，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以相對(duì)定量2-ΔΔCt法分析基因相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 益腎通癃湯藥物血清對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響

與空白血清組比較，益腎通癃湯高、中、低劑量組可顯著抑制PC-3細(xì)胞增殖，降低其貼壁生長(zhǎng)能力（P＜0.01），并呈劑量依賴性，除益腎通癃湯低劑量組外，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率有所增加。見圖1。

圖1 各組PC-3細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞抑制率比較（±s，n＝3）

4.2 益腎通癃湯藥物血清對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響

與空白血清組比較，益腎通癃湯高、中、低劑量組均可顯著促進(jìn)PC-3細(xì)胞凋亡（P＜0.05），并呈劑量依賴性。見圖2。

圖2 各組PC-3細(xì)胞凋亡比較（±s，n＝3）

4.3 益腎通癃湯藥物血清對(duì)PC-3細(xì)胞侵襲、遷移的影響

與空白血清組比較，益腎通癃湯高、中、低劑量組可顯著降低PC-3細(xì)胞體外侵襲、遷移能力（P＜0.05），并呈劑量依賴性。見圖3、圖4。

圖4 各組PC-3細(xì)胞遷移能力比較（±s，n＝3）

4.4 益腎通癃湯對(duì)PC-3細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

與空白血清組比較，益腎通癃湯高、中、低劑量組PC-3細(xì)胞Snail、Ras、p-ERK1/2、ERK1/2、N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)均下調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5、表1。

圖5 各組PC-3細(xì)胞蛋白免疫印跡圖

表1 各組PC-3細(xì)胞Snail、ERK1/2、p-ERK1/2、Ras、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組PC-3細(xì)胞Snail、ERK1/2、p-ERK1/2、Ras、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白血清組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與益腎通癃湯低劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與益腎通癃湯中劑量組比較，△P＜0.05

組別 n Snail EPK1 EPK2 p-EPK1 p-EPK2 空白血清組 3 1.01±0.06 0.97±0.08 1.02±0.06 1.07±0.14 0.93±0.05 益腎通癃湯低劑量組 3 0.73±0.03** 0.78±0.04** 0.66±0.04** 0.95±0.06* 0.72±0.03* 益腎通癃湯中劑量組 3 0.74±0.04** 0.70±0.02**# 0.57±0.01**# 0.73±0.04**# 0.64±0.02**# 益腎通癃湯高劑量組 3 0.52±0.02**#△ 0.61±0.02**##△ 0.47±0.01**##△ 0.64±0.02**##△ 0.51±0.01**##△ 組別 n Ras E-cadherin N-cadherin MMP-9 空白血清組 3 1.06±0.05 0.56±0.05 0.91±0.07 1.02±0.07 益腎通癃湯低劑量組 3 0.73±0.02** 0.88±0.04** 0.74±0.02** 0.78±0.03** 益腎通癃湯中劑量組 3 0.63±0.01**# 1.02±0.06**# 0.65±0.02*# 0.71±0.05**# 益腎通癃湯高劑量組 3 0.57±0.01**#△ 1.13±0.08**#△ 0.47±0.01**##△ 0.53±0.03**##△

4.5 益腎通癃湯對(duì)PC-3細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響

與空白血清組比較，益腎通癃湯低、中、高劑量組PC-3細(xì)胞Ras、ERK1、N-cadherin mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；益腎通癃湯高、中劑量組PC-3細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；益腎通癃湯低劑量組PC-3細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組PC-3細(xì)胞Ras、ERK1、E-cadherin、N-cadherin mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組PC-3細(xì)胞Ras、ERK1、E-cadherin、N-cadherin mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白血清組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與益腎通癃湯低劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與益腎通癃湯中劑量組比較，△P＜0.05

組別 n Ras ERK1 E-cadherin N-cadherin 空白血清組 3 1.04±0.05 0.98±0.06 0.69±0.05 1.02±0.07 益腎通癃湯低劑量組 3 0.83±0.05* 0.82±0.04* 0.68±0.04 0.92±0.05* 益腎通癃湯中劑量組 3 0.67±0.04**# 0.67±0.05*# 0.92±0.04*# 0.64±0.04**# 益腎通癃湯高劑量組 3 0.52±0.04**#△ 0.60±0.03**#△ 1.21±0.06**##△ 0.56±0.05**#△

5 討論

根據(jù)臨床表現(xiàn)，前列腺癌屬中醫(yī)學(xué)“癥瘕”“積聚”“癃閉”等范疇。全國(guó)名中醫(yī)陳其華教授認(rèn)為陰陽(yáng)失調(diào)是前列腺癌發(fā)生的基本病機(jī)，陽(yáng)虛陰結(jié)是對(duì)前列腺癌病機(jī)的高度概括，機(jī)體陽(yáng)氣虛衰，臟腑功能失調(diào)，正氣無力抗邪，各類病理產(chǎn)物如瘀血、痰濁、濕阻、癌毒等阻滯氣機(jī)，氣血不行，膠結(jié)于下焦精室，終致本病發(fā)生。前列腺癌多為本虛標(biāo)實(shí)之證，往往以陽(yáng)氣虧虛為本，瘀毒久積、邪郁下焦為標(biāo)，虛、毒、瘀夾雜，以虛為主。益腎通癃湯方中補(bǔ)骨脂溫腎助陽(yáng)、固精縮尿、補(bǔ)益精血，激發(fā)腎中陽(yáng)氣。現(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)骨脂具有提升免疫、抗氧化、抗腫瘤作用，其化學(xué)成分補(bǔ)骨脂定及補(bǔ)骨脂素能顯著抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[8-9]；熟地黃補(bǔ)血養(yǎng)陰、填精益髓，為補(bǔ)益精血之要藥，同時(shí)熟地黃與補(bǔ)骨脂陰陽(yáng)相得，互為補(bǔ)充；黃芪益氣升陽(yáng)，為補(bǔ)氣要藥，氣行則血行，使瘀滯得散，陰寒、痰濁、瘀毒更無滯停之處，則“陰結(jié)”之癌瘤自消；三棱、莪術(shù)為攻積除堅(jiān)經(jīng)典藥對(duì)，癌毒留戀絡(luò)脈，血瘀、痰濁、寒凝等膠結(jié)積聚，三棱、莪術(shù)為化瘀散結(jié)通絡(luò)要藥。全方攻補(bǔ)兼施，諸藥合用，共達(dá)陰陽(yáng)雙補(bǔ)、抗癌解毒、化痰散瘀之功。

本課題組前期臨床研究顯示，益腎通癃湯能有效治療前列腺癌[6]。Moore等[10]研究表明，惡性腫瘤的發(fā)病、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程均與眾多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路異常激活相關(guān)，此類信號(hào)通路異常激活造成的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)過程異常是惡性腫瘤發(fā)生的標(biāo)志性特征之一。Ras/ERK信號(hào)通路目前被發(fā)現(xiàn)在真核細(xì)胞中廣泛存在，其主要功能是調(diào)控組織細(xì)胞的終末分化、分裂增殖、周期、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[11]。研究顯示，Ras/ERK信號(hào)通路在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、口腔癌等多類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程中扮演重要角色[12]。在Ras/ERK信號(hào)通路中，Ras蛋白是原癌基因c-ras的表達(dá)產(chǎn)物，也是惡性腫瘤發(fā)生過程中最常見的突變蛋白；ERK蛋白是Ras/ERK信號(hào)通路下游的關(guān)鍵蛋白，ERK被激活后經(jīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境運(yùn)送至細(xì)胞核，對(duì)細(xì)胞內(nèi)諸多信號(hào)通路的重要因子進(jìn)行激活或滅活，調(diào)控相應(yīng)的關(guān)鍵靶基因轉(zhuǎn)錄，使相關(guān)蛋白表達(dá)或活性異常，最終推進(jìn)相應(yīng)基因表觀修飾異常，導(dǎo)致細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化[13]。Ngalame等[14]在前列腺癌組織中發(fā)現(xiàn)Ras/ERK信號(hào)通路異常激活，其通過激活該信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致前列腺癌發(fā)生。

此外，Wang等[15]認(rèn)為，前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移是前列腺癌發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是前列腺癌發(fā)生及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的必經(jīng)過程。Qiu等[16]研究顯示，Ras/ERK信號(hào)通路與EMT密切相關(guān)。Cai等[17]研究表明，前列腺癌細(xì)胞EMT一旦激活，其腫瘤細(xì)胞各種惡性生物學(xué)行為明顯提升，并調(diào)控前列腺癌發(fā)展，該過程中E-cadherin扮演關(guān)鍵性角色，而N-cadherin則與之相反。Snail是前列腺癌發(fā)生發(fā)展及EMT過程中的主要調(diào)節(jié)因子，其通過調(diào)節(jié)E-cadherin表達(dá)推進(jìn)EMT過程[18]。MMP-9是關(guān)鍵細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解酶，其可直接調(diào)控惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移進(jìn)程，也可通過水解細(xì)胞外基質(zhì)，調(diào)控細(xì)胞黏附及腫瘤微小血管生成，在癌性浸潤(rùn)進(jìn)程中起關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果顯示，益腎通癃方能有效抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，并能降低前列腺癌細(xì)胞侵襲及遷移能力。同時(shí)益腎通癃湯各劑量均可下調(diào)Snail、Ras、p-ERK1/2、ERK1/2、N-cadherin、MMP-9蛋白的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin表達(dá)，降低Ras、ERK1、N-cadherin mRNA的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin mRNA的表達(dá)，提示益腎通癃湯治療前列腺癌的作用機(jī)制可能與其抑制前列腺癌EMT進(jìn)程，調(diào)控Ras/ERK信號(hào)通路活化有關(guān)。但益腎通癃湯抑制前列腺癌細(xì)胞增殖及侵襲、促進(jìn)其凋亡是直接還是間接通過Ras/ERK信號(hào)通路，抑制前列腺癌EMT是否還存在其他關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，仍需今后進(jìn)一步深入研究。