安腸愈瘍湯對潰瘍性結腸炎大鼠三葉因子3蛋白表達及腸道菌群的影響

王晗潞，王帥，孫大娟，梁峻尉，尹德菲，遲莉麗

1.山東中醫藥大學中醫學院，山東 濟南 250014；2.山東省中醫院，山東 濟南 250014

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性炎癥性疾病，其發生發展與遺傳易感性、免疫系統失調、腸道菌群紊亂、炎癥介質等因素密切相關。研究發現，腸黏膜屏障功能失調、腸道菌群紊亂在UC的發病中扮演重要角色[1-2]。三葉因子3（TFF3）是腸黏膜修復因子，可與黏蛋白相互作用，增強黏膜屏障功能，在保護胃腸道黏膜和潰瘍修復過程中發揮重要作用[3-4]。腸道菌群失調使腸致病菌數量增多，導致腸黏膜通透性增加，致病菌、毒素更易通過腸黏膜，進而引發腸道長期炎癥刺激，甚至促使結腸黏膜癌變[5-6]。因此，修復損傷腸黏膜，恢復腸道菌群平衡是治療UC的關鍵。目前，西醫治療UC的藥物主要是5-氨基水楊酸類制劑、糖皮質激素等，雖起效快，療效確切，但易發生不良反應。中藥在防治UC方面具有獨特優勢，具有修復腸黏膜損傷、調節微生態等作用，可長期維持UC緩解、降低復發率[7-11]。本課題組前期從基因水平探討了安腸愈瘍湯對UC大鼠TFF3的調控作用[12]，但安腸愈瘍湯對TFF3蛋白表達及腸道菌群的影響，以及TFF3與腸道菌群的相關性尚不明確。本研究在前期研究基礎上，進一步觀察安腸愈瘍湯對UC大鼠TFF3蛋白的調控作用及對腸道菌群的影響，并探討TFF3與腸道菌群的關系，為中西醫結合治療UC提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD大鼠36只，雌雄各半，體質量（200±20）g，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物許可證號SCXK（魯）20190003。飼養于山東省中醫院動物實驗中心，溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，進食標準飼料，通風環境。實驗過程通過山東省中醫院動物倫理審查批準（AWE-2019-002）。

1.2 藥物及制備

安腸愈瘍湯（黃芪30g，敗醬草30g，黃連9g，麩炒白術30g，薏苡仁30g，黃芩9g，白及12g，木香9g，檳榔15g，炒白芍12g，當歸9g，防風6g，地榆炭15g，甘草9 g），飲片購于山東省中醫院中藥房，浸泡3 h，武火煎煮25 min后再文火煎煮20 min，合并2次煎液，水煎濃縮為含原藥材0.375、0.75、1.5 g/mL，過濾，置于4 ℃冰箱保存；美沙拉嗪緩釋顆粒，法國Ethypharm，批號190108。

1.3 主要試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉（DSS，MP Biomedicals公司），Qiagen QIAamp糞便DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司），16S V4區引物515F-806R（北京諾禾致源），Phusion?高保真DNA聚合酶（美國New England Biolabs公司），產物純化Gene JET膠回收試劑盒（美國Thermo Scientific公司），Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒（美國Thermo Fisher公司），Ion S5TMXL測序系統（美國Thermo Scientific公司），16S V4區測序委托北京諾禾致源完成。移液器，法國GLISON公司；低溫離心機，美國Thermo IEC公司；ND-1000分光光度計，美國Thermo Scientific公司；化學發光圖像分析儀，日本富士公司。

1.4 分組、造模及給藥

大鼠隨機分為空白組、模型組、美沙拉嗪組和中藥低、中、高劑量組，每組6只。參考文獻[13]采用自由飲用4.5%DSS溶液7 d方法制備UC模型。各給藥組于飲用DSS溶液第2日起給予相應藥物灌胃，中藥濃度為0.375、0.75、1.5 g/mL，美沙拉嗪為0.035 g/mL，空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。給藥體積均為2 mL/100g，連續2周。

1.5 取材

陳頤磊百思不得其解，鬼子的兇殘他是知道的，南京一役，公然違反日內瓦條約，集中屠殺大批放下武器的國軍官兵。

1.6 觀測指標及檢測方法

1.6.1 結腸黏膜組織病理學評分

醫護英語的教學目的是培養具有專業學科知識又有外語技能的復合型人才，其教學逐漸成為醫學院校英語教學的一個重要組成部分。隨著大數據、人工智能時代的到來，教學與學習方式發生了翻天覆地的變化[1]。如何順應時代潮流，利用智能互聯網技術來推進醫護英語教學的創新和發展，提高醫護英語教學質量和效果是醫護英語教學者所面臨的新挑戰。筆者在安徽中醫藥高等?？茖W校一年的醫護英語教學實踐中嘗試了“智慧課堂”的教學模式，并取得了比較好的教學效果。

參照文獻[14]進行組織病理學評分，詳見表1。

表1 大鼠結腸黏膜組織病理學評分標準

各地旅游產品出現同質化現象，各類旅游產品競爭激烈，特色化、差異化的經營策略是持久競爭力的重要保證，在日間旅游項目日益飽和的情況下，夜間旅游開發實現了同類產品在不同時間段的競爭，為城市旅游開拓新的路徑[7]。在經營時間和旅游項目上，合肥夜間旅游與日間旅游錯位發展，不僅減少了旅游產品競爭群體，還給游客帶來特殊環境氛圍下的旅游體驗，有利于城市旅游保持持久的競爭力。

菌群多樣性與Shannon指數成正比，模型組Shannon指數較空白組降低；中藥中、高劑量組及美沙拉嗪組較模型組升高。菌群豐度與ACE指數成正比，模型組ACE指數較空白組降低，中藥中、高劑量組及美沙拉嗪組較模型組升高。見圖4。

1.6.3 體外糞便DNA 16S rDNA測序及質控

與空白組比較，模型組大鼠結腸黏膜組織病理學評分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結腸黏膜組織病理學評分明顯降低（P＜0.01），其中，中藥高劑量組降低最明顯。見表2。

1.7 統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行分析。計量資料用±s表示，符合正態分布用t檢驗，多組間比較若方差齊用方差分析，若方差不齊用非參數秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

干預結束后，收集大鼠糞便至無菌EP管，-80 ℃保存。大鼠麻醉后取距肛門1 cm以上結腸組織，沿腸系膜縱軸剪開，0.9%NaCl溶液沖洗，肉眼觀察炎癥、潰瘍情況，取病變最明顯組織約0.5 cm，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續切片，HE染色，剩余結腸組織-80 ℃凍存。取材結束后，大鼠注射高濃度戊巴比妥鈉溶液進行安樂死。

2 結果

2.1 病理觀察結果

空白組大鼠結腸組織完整，未見糜爛、潰瘍；模型組大鼠結腸組織可見潰瘍，局部隱窩消失，可見大量淋巴細胞、漿細胞浸潤及隱窩炎；美沙拉嗪組大鼠結腸組織黏膜下層輕度水腫，可見少量炎性細胞浸潤；中藥低劑量組大鼠結腸組織仍可見潰瘍、隱窩炎，伴大量淋巴細胞、漿細胞浸潤；中藥中劑量組大鼠結腸組織潰瘍愈合，組織輕度水腫，可見少量淋巴細胞、漿細胞浸潤；中藥高劑量組大鼠結腸組織潰瘍愈合，固有層輕度水腫，少量炎性細胞浸潤。見圖1。

1.6.2 Western blot檢測三葉因子3蛋白表達

圖1 各組大鼠結腸組織形態（HE染色，×200）

2.2 病理學評分結果

采用CTAB方法對樣本的基因組DNA進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA置于離心管，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶Barcode的特異引物、Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高保真DNA聚合酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳；根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE濃度2%瓊脂糖膠電泳純化PCR產物，剪切回收目標條帶。使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫構建，經Qubit定量和文庫檢測合格后，使用Ion S5TMXL測序系統測序。利用Uparse軟件對所有樣品的全部Clean Reads進行聚類，默認以97%一致性將序列聚類為OTUs，進行物種注釋分析（閾值0.8～1），使用R軟件繪制稀釋曲線、物種累積曲線，使用Qiime軟件計算Shannon指數、ACE指數，并統計門、屬水平OTU聚類情況，進行相對豐度分析。

表2 各組大鼠結腸黏膜組織病理學評分比較（±s）

表2 各組大鼠結腸黏膜組織病理學評分比較（±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別 只數 病理學評分 空白組 6 2.50±2.07 模型組 6 15.33±1.51## 中藥低劑量組 6 9.50±2.51** 中藥中劑量組 6 5.33±1.16** 中藥高劑量組 6 1.83±1.60** 美沙拉嗪組 6 2.83±1.17**

2.3 安腸愈瘍湯對模型大鼠三葉因子3表達的影響

詳參拙作《陸游的雙面形象及其詩文之形態與觀念》，《陸游與鑒湖》，61-72頁，人民出版社2011年12月。

眾所周知，16世紀以來釣魚島就屬于中國領土，而非日本長期侈談的“無主島嶼”。而現在的釣魚島問題之所以成為“問題”，完全是由于日本的血腥侵略造成的。

圖2 各組大鼠結腸組織TFF3蛋白表達比較（±s，每組6只）

2.4 腸道菌群測序質量評估結果

觀察稀釋曲線，曲線隨著測序深度的增加而逐漸平坦，提示測序深度足夠。觀察物種累積箱形圖，曲線隨著樣品量的增加而逐漸平坦，提示樣品量足夠。見圖3。

圖3 腸道菌群測序質量評估

2.5 腸道菌群多樣性、豐度分析結果

大鼠結腸組織裂解，離心，取上清液，電泳，轉膜，取出NC膜，平皿1×PBST洗2遍，5%脫脂牛奶封閉過夜，加TFF3一抗、二抗孵育，漂洗后顯影、定影，圖像分析。

與空白組比較，模型組大鼠結腸組織TFF3蛋白表達明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結腸組織TFF3蛋白表達明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），其中，中藥高劑量組升高最明顯。見圖2。

圖4 各組大鼠腸道菌群Shannon指數、ACE指數箱型圖

2.6 大鼠腸道菌群結構組成

門水平上優勢菌門為厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidetes，見圖5。各組F/B比值由低到高依次為空白組（1.17）＜中藥高劑量組（1.20）＜美沙拉嗪組（1.28）＜中藥中劑量組（1.38）＜中藥低劑量組（1.72）＜模型組（1.94），見表3。屬水平上優勢菌屬前2位分別為擬桿菌屬Bacteroides、乳桿菌屬Lactobacillus。模型組較空白組擬桿菌屬豐度升高，乳桿菌屬豐度下降；與模型組比較，各給藥組擬桿菌屬豐度下降，乳桿菌屬豐度升高。見圖6。

圖6 各組大鼠腸道菌群屬水平豐度柱形累加圖

表3 各組大鼠腸道菌群F/B比值比較

圖5 各組大鼠腸道菌群門水平豐度柱形累加圖

3 討論

UC治療目標從最初的“癥狀改善和臨床緩解”逐漸轉變為“誘導并維持臨床緩解及黏膜愈合”[15-16]?；謴驼Ｄc黏膜屏障功能是治療UC的關鍵，腸黏膜屏障由機械屏障、生物屏障、免疫屏障、化學屏障共同構成[17]。TFF3在機械屏障中發揮重要作用，可刺激血管表皮生長因子表達，促進血管生成，修復腸上皮[18]。研究表明，TFF3是UC黏膜愈合的生物標志物之一[19]。腸道菌群作為生物屏障，可促進腸道相關淋巴組織發育及腸道免疫細胞分化，保護腸道[20]。菌群豐度、多樣性減少，可使腸道屏障功能受損而引發UC。F/B比值被認為是評估腸道菌群紊亂的關鍵參數。研究發現，在急性UC發病過程中F/B比值顯著升高[21]。擬桿菌屬為致病菌，當腸道菌群失調后，可誘導免疫反應，引起大量炎性細胞聚集在腸黏膜[5]。乳桿菌屬為益生菌，能維護腸黏膜屏障穩定[22]。研究發現，UC患者糞便中致病菌如腸球菌、擬桿菌等數量增多[23]。正常大鼠腸道菌群以乳酸菌屬、普雷沃氏菌屬等有益菌為主，UC大鼠埃希氏-志賀菌屬、擬桿菌屬等致病菌占主要優勢[24]。

中醫理論認為，脾氣虧虛、邪毒濕熱，濕熱蘊腸，導致UC的發生發展，本課題組基于以上病機自擬安腸愈瘍湯以健脾益氣、化濕解毒、理氣止血。

本研究結果顯示，各給藥組TFF3蛋白表達較模型組上調，且呈劑量依賴性，同時發現各給藥組腸道菌群豐度、多樣性均有提升，益生菌增加，致病菌減少。由此推測，中藥復方可促使腸黏膜修復因子上調，恢復腸道菌群多樣性，增加益生菌的同時減少致病菌，從而修復腸黏膜。

三是對以“合同”之名行“行政”之實不服的救濟方式。出讓人在出讓合同中將一些實為行政行為，通過合同約定為合同行為或者出讓人在行使合同權利時，借 “合同”之名，行“行政強制”之實運用國家強制力實施的一些行為，因這些行為本質上屬于行政行為，受讓人可通過行政復議、行政訴訟的方式進行救濟。如合同約定出現違約行為時收回開采權、注銷采砂許可證、停業整頓等。

TFF3與腸道菌群關系密切，其與黏蛋白相互作用形成腸上皮黏液層作為保護膜，可限制共生菌在黏膜內層定植，抑制腸道菌群與腸上皮接觸，有效阻止腸微生物等對組織損傷，還為腸道菌群與宿主共生狀態提供環境條件，為腸道菌群提供營養物質及結合位點[25]。當TFF3分泌減少，黏液層變薄或消失，腸黏膜通透性增加，細菌或其代謝產物穿過腸黏膜表面黏液層，粘附于腸上皮細胞，導致腸道微生物群的移位和免疫系統的激活對組織產生損傷[26]。安腸愈瘍湯是間接通過影響TFF3表達進而調控腸道菌群，抑或直接對腸道菌群產生影響，有待今后進一步研究。