祛痰活血方對非酒精性脂肪性肝病模型大鼠肝組織miR-27a、p38MAPK、AQP9表達的影響

楊昌碧，汪靜，鄭丁

西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除過量飲酒和其他明確導致肝損傷因素外所致的肝細胞內脂肪過量沉積，是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝損傷[1]。NAFLD發病機制復雜，公認的是以胰島素抵抗為中心的“二次打擊”學說[2]，胰島素抵抗導致的脂代謝紊亂及肝臟中三酰甘油（TG）過度沉積是NAFLD的發病基礎。有研究報道，NAFLD小鼠肝組織miR-27a表達降低，miR-27a過表達可減輕小鼠肝組織TG的含量，從而減輕脂肪肝[3]。Appari 等[4]研究發現，miR-27a通過參與p38MAPK磷酸化而影響其下游基因的表達。水通道蛋白9（AQP9）是肝細胞攝取甘油的特異性通道，研究發現NAFLD大鼠肝細胞中p38MAPK和AQP9蛋白及mRNA表達顯著升高，抑制p38MAPK表達及磷酸化可降低AQP9蛋白及mRNA的表達[5]。祛痰活血方是西南醫科大學附屬中醫醫院孫同郊教授治療脂肪肝的經驗方，具有活血化瘀、疏肝健脾功效。前期研究發現，祛痰活血方可降低TG、總膽固醇（TC）水平，總有效率達88%[6]。動物實驗發現，祛痰活血方可抑制p38MAPK信號通路，減少AQP9的表達，減少TG在肝細胞蓄積，改善NAFLD大鼠肝臟脂肪變性[7]。因此推測miR-27a可能通過調節p38MAPK信號通路影響AQP9的表達，進而影響TG的形成。本實驗采用高脂飼料喂養建立NAFLD大鼠模型，觀察祛痰活血方對大鼠肝組織miR-27a、p38MAPK及AQP9表達的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物及飼料

清潔級雄性SD大鼠32只，體質量180～200g，成都達碩生物科技有限公司，動物生產許可證號SCXK（川）2020-24，飼養于溫度20～24 ℃、相對濕度50%～60%環境。高脂飼料（82%基礎飼料＋10%豬油＋2%膽固醇＋5%蛋黃粉＋1%膽鹽），成都達碩生物科技有限公司，許可證號SCXK（川）2020-028。

1.2 藥物及制備

祛痰活血方（法半夏10g，陳皮10g，茯苓10g，丹參15g，郁金15g，山楂15g，黃芩10g，薏苡仁15g，澤瀉15g，柴胡10g，決明子10 g），西南醫科大學附屬中醫醫院藥劑科提供。將所有飲片混勻，2 500 mL蒸餾水浸泡30 min，煎煮30 min，收集藥液，藥渣再加1 000 mL蒸餾水煎煮30 min，合并2次藥液，濃縮至含原藥材2.16 g/mL，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3 主要試劑和儀器

天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、TG、TC、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號分別為20200827、20200829、20200831、20200831、20200829、20200828；miRNA提取試劑盒、總RNA提取試劑盒，北京百泰克生物技術有限公司，批號分別為RP5901、RP2401；反轉錄試劑盒、SYBR?Green RT-PCR Master Mix，日本Toyobo公司，批號分別為FSQ-201、QRT-101；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western一抗二抗去除液，上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為P0033-1、P0010S、P0025；AQP9、p38MAPK、p-p38MAPK、GAPDH抗體，英國Abcam公司，貨號分別為ab15127、ab170099、ab4822、ab8245；山羊抗兔IgG/HRP抗體，貨號bs-0295G-HRP，北京博奧森生物技術有限公司；ECL顯影液，美國Thermo Scientific公司，批號35055。全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司，型號IMARK），PCR擴增儀（德國Eppendorf公司，型號6311000070），正置顯微鏡（日本尼康公司，型號Nikon E200），超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司，型號SW-CJ-1G），臺式高速冷凍離心機（上海成貫儀器有限公司，型號Eppendorf 5427R），-80 ℃超低溫冰箱（美國Thermo Scientific公司，型號Thermo705），凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司，型號BIO-RADXR）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

32只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常組6只、造模組26只，正常組予普通飼料喂養，造模組予高脂飼料喂養，均自由飲水。造模第8周，隨機處死2只造模組大鼠，取肝組織，HE染色確認造模成功[8]。剩余成模大鼠隨機分為模型組和祛痰活血方低、中、高劑量組，每組6只。參照人與動物給藥劑量換算公式[9]，祛痰活血方低、中、高劑量組按5.4、10.8、21.6 g/kg劑量灌胃給藥（相當于成人日用劑量3、6、12倍），1次/d，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，給藥體積10 mL/kg。除正常組外，其余各組大鼠繼續予高脂飼料喂養，連續4周。

2.2 標本采集

給藥4周后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（10 mL/kg）麻醉大鼠，腹部消毒，做U形切口，分離暴露腹主動脈，取血約5 mL，室溫靜置1 h，1 370×g離心10 min，取上清液，分裝待測或-80 ℃保存。大鼠脫頸處死，快速取出肝臟，生理鹽水沖洗，吸干水分，稱重，取肝左葉浸泡于福爾馬林中，常溫固定過夜，行HE染色；取肝右外葉約1 cm×1 cm×1 cm組織行油紅O染色；余肝組織剪碎，放入凍存管中，-80 ℃冰箱保存。

2.3 肝功能檢測

取大鼠血清，全自動生化分析儀檢測大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL、HDL含量。

2.4 HE染色

將肝左葉用福爾馬林固定過夜，石蠟包埋，切片（厚度約5 μm）；二甲苯脫蠟，梯度乙醇（100%、90%、80%、75%）浸泡脫水；蘇木素染色，蒸餾水沖洗；伊紅染色，蒸餾水沖洗；梯度乙醇（75%、80%、90%、100%）脫水，二甲苯透明，自然晾干，中性樹膠封片，顯微鏡下進行圖像采集。

2.5 油紅O染色

將肝右外葉用福爾馬林固定過夜；10%、20%蔗糖溶液分別浸泡1、5 h，再放入30%蔗糖溶液中4 ℃冷藏過夜；將組織置于液氮中，3～5 s后取出，重復3～4次；OCT包埋盒包埋，-20 ℃冷卻；切片（厚約7 μm），置于福爾馬林中固定10 min，蒸餾水沖洗；60%異丙醇浸洗30 s；改良油紅O染色劑染色10 min；60%異丙醇洗10 s，蒸餾水沖洗；蘇木素染色液復染1～2 min，蒸餾水沖洗，自然干燥；甘油明膠封片，顯微鏡下進行圖像采集。

2.6 RT-PCR檢測

miRNA提取試劑盒提取肝組織miRNA；總RNA提取試劑盒提取肝組織總RNA。將RNA反轉錄為cDNA，反轉錄條件：37 ℃、15 min，50 ℃、5 min，98 ℃、5 min。參照SYBR?Green RT-PCR試劑盒說明書進行PCR反應，反應條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共40個循環。miRNA-27a以U6為內參，其余指標以GAPDH為內參，采用相對定量2-ΔΔCt法進行分析。miR-27a引物序列：F 5’-GC GCGTTCACAGTGGCTAAG-3’，R 5’-AGTGCAGGG TCCGAGGTATT-3’，擴增產物長度142 bp；AQP9引物序列：F 5’-AAGGACGGTGCCAAGAA-3’，R 5’-AT CACGACTGCCGATGC-3’，擴增產物長度197 bp；p38MAPK引物序列：F 5’-GGACCTAAAGCCCAGC AA-3’，R 5’-CAGCCCACGGACCAAATA-3’，擴增產物長度186 bp；U6引物序列：F 5’-CTCGCTTCGGCA GCACATATACTR-3’，R 5’-ACGCTTCACGAATTTG CGTGTC-3’，擴增產物長度168 bp；GAPDH引物序列：F 5’-CC ATCCACAGTCTTCTGAGT-3’，R 5’-CCT CAAGATT GTCAGCAAT-3’，擴增產物長度141 bp。每組設6個復孔。

2.7 Western blot檢測

提取肝組織總蛋白，BCA法測定蛋白含量；等量蛋白上樣，電泳；100 V轉膜60 min；5%脫脂牛奶封閉90 min；按1∶1 000稀釋AQP9、p-p38MAPK、p38MAPK、GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5 min；按1∶1 000稀釋二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；滴加ECL顯影液，采用凝膠成像系統掃描并測定灰度值。

3 統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行分析。實驗數據以±s表示，多組間比較用方差分析，組間比較用Q檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 祛痰活血方對模型大鼠肝功能指標的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL水平明顯升高（P＜0.05），HDL水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，祛痰活血方各劑量組大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL水平明顯降低（P＜0.05），HDL水平明顯升高（P＜0.05），其中祛痰活血方高劑量組作用最明顯。結果見表1。

表1 各組大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL、HDL水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL、HDL水平比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與祛痰活血方低劑量組比較，△P＜0.05；與祛痰活血方中劑量組比較，▲P＜0.05

組別 只數 AST/（U/L） ALT/（U/L） TG/（mmol/L） TC/（mmol/L） LDL/（mmol/L） HDL/（mmol/L）正常組 6 96.72± 5.61 38.68±3.60 0.76±0.06 1.50±0.10 0.81±0.08 1.17±0.09 模型組 6 177.61±12.05* 73.63±3.49* 1.58±0.05* 3.81±0.15* 1.72±0.08* 0.47±0.07* 祛痰活血方低劑量組 6 147.99±13.20# 62.35±8.22# 1.23±0.07# 2.92±0.08# 1.21±0.05# 0.85±0.11# 祛痰活血方中劑量組 6 116.69± 3.89# 44.76±7.72# 0.98±0.03# 2.53±0.14# 1.08±0.06# 1.02±0.18# 祛痰活血方高劑量組 6 105.16± 7.70#△▲ 41.31±3.37#△▲ 0.86±0.08#△▲ 1.83±0.15#△▲ 0.94±0.07#△▲ 1.11±0.11#△▲

4.2 HE染色結果

正常組大鼠肝小葉形態正常，肝細胞無明顯脂肪變性、腫脹、壞死及增生，且圍繞中央靜脈呈放射狀分布；模型組大鼠肝小葉形態欠完整，肝細胞分布紊亂，且明顯變性腫脹及脂肪變性；祛痰活血方各劑量組大鼠病變較模型組明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織形態（HE染色，×200）

4.3 油紅O染色結果

正常組大鼠肝細胞未見明顯紅色脂滴；模型組大鼠肝細胞脂滴較多，腫脹及脂肪變性明顯；祛痰活血方各劑量組大鼠可見散在分布于胞漿的紅色脂滴，細胞結構稍紊亂，少許肝細胞脂肪變性，病變程度較模型組減輕。見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織形態（油紅O染色，×400）

4.4 祛痰活血方對模型大鼠肝組織miR-27a、AQP9、p38MAPK mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織miR-27a mRNA表達明顯降低，AQP9、p38MAPK mRNA表達明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，祛痰活血方各劑量組大鼠肝組織miR-27a mRNA表達明顯升高，AQP9、p38MAPK mRNA表達明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），其中，祛痰活血方高劑量組作用最明顯（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠肝組織miR-27a、AQP9、p38MAPK mRNA表達比較（±s）

表2 各組大鼠肝組織miR-27a、AQP9、p38MAPK mRNA表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與祛痰活血方 低劑量組比較，△P＜0.05；與祛痰活血方中劑量組比較，▲P＜0.05

組別 只數 miR-27a AQP9 p38MAPK 正常組 6 1.002±0.078 1.002±0.080 1.004±0.118 模型組 6 0.480±0.127* 1.779±0.091* 1.589±0.106* 祛痰活血方低劑量組 6 0.576±0.056# 1.594±0.050# 1.314±0.050# 祛痰活血方中劑量組 6 0.778±0.087# 1.311±0.068# 1.212±0.062# 祛痰活血方高劑量組 6 0.967±0.070#△▲ 1.127±0.136#△▲ 1.032±0.114#△▲

4.5 祛痰活血方對模型大鼠肝組織水通道蛋白9和p-p38MAPK蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織AQP9和p-p38MAPK蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，祛痰活血方各劑量組大鼠肝組織AQP9和p-p38MAPK蛋白表達明顯降低（P＜0.05），其中，祛痰活血方高劑量組降低最明顯。結果見圖3、表3。

表3 各組大鼠肝組織AQP9、p-p38MAPK蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠肝組織AQP9、p-p38MAPK蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與祛痰活血 方低劑量組比較，△P＜0.05；與祛痰活血方中劑量組比較，▲P＜0.05

組別 只數 AQP9/GAPDH p-p38MAPK/p38MAPK正常組 6 0.308±0.180 0.254±0.018 模型組 6 0.879±0.091* 0.609±0.106* 祛痰活血方低劑量組 6 0.649±0.058# 0.414±0.050# 祛痰活血方中劑量組 6 0.411±0.098# 0.292±0.072# 祛痰活血方高劑量組 6 0.327±0.132#△▲ 0.275±0.114#△▲

圖3 各組大鼠肝組織AQP9、p-p38MAPK蛋白免疫印跡圖

5 討論

根據臨床表現，NAFLD屬中醫學“肝癖”“脅痛”范疇。NAFLD患者多形體肥胖、痰濁內生、血脈瘀滯[10]。孫同郊教授認為痰瘀互結是其基本病機，其病因可概括為過食肥甘厚味，或久臥久坐，體內痰盛，或七情內傷，或先天稟賦異常等，導致脾虛運化無權，肝疏泄失職，水谷精微不能正常輸化，水濕內停，痰濁內生，氣滯血瘀，濕痰瘀互結于肝而成[11]，多屬本虛標實之證，以肝脾腎虛為本，痰濁、氣滯血瘀為標。祛痰活血方為二陳湯加減而成，方中柴胡、黃芩疏肝行氣燥濕，法半夏燥濕化痰，陳皮行氣化痰，茯苓健脾利濕，薏苡仁、澤瀉健脾滲濕泄濁，決明子清熱解毒，郁金、丹參、山楂活血化瘀，諸藥合用，可達理氣祛痰、活血化瘀、疏肝健脾之效。

正常情況下脂肪細胞中TG能分解為甘油和脂肪酸，釋放入血后在肝細胞內合成TG，并與載脂蛋白、膽固醇等結合形成極低密度脂蛋白，轉運到肝外組織儲存或加以利用，達到動態平衡。NAFLD的形成與肝臟中TG過度蓄積相關。Zhang等[12]發現，miR-27a過表達可減輕小鼠肝組織TG含量，從而減輕NAFLD。此外，研究顯示miR-27a在高脂飲食誘導的NAFLD大鼠肝組織中低表達，而p38MAPK mRNA及蛋白表達升高[13]。課題組前期研究發現，祛痰活血湯能顯著減輕NAFLD大鼠肝臟脂肪變性程度，降低肝細胞凋亡指數，調節脂代謝紊亂[14]；祛痰活血方藥物血清能抑制NAFLD大鼠原代肝細胞內p38MAPK蛋白的磷酸化，降低AQP9表達，提示p38MAPK信號通路可能是祛痰活血方治療NAFLD的關鍵通路之一[7]。本研究結果顯示，祛痰活血方可上調NAFLD大鼠肝臟miR-27a的表達，抑制p38MAPK通路激活和下調AQP9表達，減少肝臟中脂肪生成，改善肝功能，進而減輕肝臟脂肪變性。