格隆溴銨對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥和肺損傷的影響

侯云鶴 楊少朋 于超 張學艷

慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)屬于慢性進行性肺部疾病，具有氣流受限不完全可逆的特點，其發(fā)病因素與感染、吸煙以及氧化應激等有關，顆粒吸入以及氣道炎性反應在慢阻肺疾病進展中具有重要意義。香煙燃燒產生的氧化物質可以誘發(fā)脂類以及細胞膜成分發(fā)生過氧化激活氧化應激反應，破壞細胞內DNA，引起組織細胞損傷。慢阻肺產生炎癥反應特點表現(xiàn)為中性粒細胞、巨噬細胞水平升高，中性粒細胞介導的炎性因子水平增加會加重肺部細胞的炎癥反應與組織損傷。乙酰膽堿可以緩解氣道上皮細胞、巨噬細胞釋放炎性因子，可能與毒蕈堿受體有關，例如噻托溴銨為毒蕈堿乙酰膽堿型受體，不僅可以舒張氣道平滑肌，還可以減輕氣道炎癥及肺功能[1]。格隆溴銨是新式長效毒蕈堿受體拮抗劑，對慢阻肺患者的治療效果明顯[2-3]，但有關格隆溴銨的作用機制研究較少。因此，本文通過制備慢阻肺大鼠模型，探索格隆溴銨對慢阻肺大鼠氣道炎癥與肺組織的影響以及可能存在的作用機制，為慢阻肺臨床用藥提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器 格隆溴銨(赫澎上海生物科技有限公司)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)ELISA KIT(上海信帆生物科技有限公司)，角質形成細胞衍生趨化因子(keratinocyte-derived chemokine，KC)ELISA KIT(上海奧陸生物科技有限公司)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)ELISA KIT(上海晶抗生物工程有限公司)、兔抗鼠基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)、基質金屬蛋白酶抑制物-1(matrix metalloproteinase inhibitor-1，TIMP-1)抗體(武漢菲恩生物科技有限公司)，顯微鏡(Ti2-U，NIKON)，切片機(HM 340E，賽默飛)，超聲霧化器(S-888E，南京道芬電子有限公司)。

1.2 動物及分組 SPF級SD雄性健康大鼠30只，4～5周齡，體質量190～210 g，購于南方醫(yī)科大學，生產許可證號SCXK(粵)2016-0041，適應性飼養(yǎng)1周，溫度20～25℃，濕度40%～50%，人工光照晝夜時間各12 h，飲水自由。采用隨機數(shù)字表將SD大鼠均分為對照組、模型組、干預組，每組各10只。研究時間為2019年3月至6月。

1.3 實驗方法 模型制備[4]以及給藥方法[5-6]：將模型組、干預組大鼠于造模第1天、第14天時麻醉，插入氣管，向氣管內注入LPS 200μg/200μL，將大鼠左右旋轉，使LPS進入大鼠肺組織，對照組注入等體積的生理鹽水；于2～12 d、15～28 d時，模型組、干預組大鼠置于密閉箱中進行煙熏，每日熏15支煙，每天煙熏5次，每次持續(xù)30 min，對照組除不作煙熏處理外，其余操作相同；干預組大鼠在2～12 d、15～28 d階段進行煙熏前30 min，根據(jù)格隆溴銨成年人使用的最大劑量以及大鼠、成人藥物折算系數(shù)(W)6.25進行換算，將格隆溴銨8μg溶于10 mL生理鹽水，采用大鼠霧化給藥儀進行霧化吸入治療10 min，模型組吸入等體積的生理鹽水。

1.4 指標檢測 各組大鼠于實驗第29天時開始進行各項指標檢測，1%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉處死各組大鼠，開胸，右下葉肺進行結扎，注入無菌預冷PBS進行支氣管肺泡灌洗，灌洗3次，灌洗液于4℃2 500 r/min離心10 min，收集上清用于ELISA法檢測TNF-α、KC、GSH含量，操作流程按照試劑盒說明書進行，沉淀進行劉氏染色液，用于白細胞計數(shù)分類。大鼠開胸后，取一部分左肺迅速置于液氮中，于-80℃超低溫冰箱保存，用于肺組織中蛋白、基因表達量檢測；另一部分左肺置于4%甲醛中性溶液中固定，用于肺組織病理結構觀察。

1.4.1 HE染色 取已固定大鼠肺組織用于常規(guī)石蠟切片，蘇木精、伊紅染色、脫水、透明、固定封片，顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織結構變化以及組織炎癥浸潤情況，參照文獻等[7]對氣管、血管、肺間質周圍炎性組織浸潤程度進行評分，每個視野中炎癥細胞數(shù)目為0視為無炎癥(0分)、每個視野中炎癥細胞數(shù)目＜10個視為輕度炎癥(1分)、每個視野中炎癥細胞數(shù)目為10～25個視為中度炎癥(2分)、每個視野中炎癥細胞數(shù)目＞25個視為重度炎癥(3分)。

1.4.2 Western blot 提取肺組織總蛋白，調整蛋白質濃度，經SDS-PAGE電泳、膜轉移至PVDF膜，加入MMP-9、TIMP-1、Western blot檢測蛋白水平的內參(GAPDH)一抗，于4℃條件下孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入經HRP標記的二抗繼續(xù)孵育1 h，根據(jù)ECL試劑盒說明書對蛋白條帶進行顯影、定影，觀察各組蛋白條帶成像情況，并進行蛋白條帶分析。

1.4.3 RT-PCR 采用trizol法提取肺組織的總RNA，根據(jù)逆轉錄cDNA試劑盒說明書逆轉錄生成cDNA，參考RT-PCR試劑盒說明書進行PCR反應體系配比、擴增體系設置，所用內參基因及MMP-9、TIMP-1引物均有上海生工提供，以2-△△Ct計算目標基因的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件，計量資料以(±s)形式表示，若各組數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布且方差齊，采用單因素分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；若為非正態(tài)分布數(shù)據(jù)則采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗，檢驗水準ɑ＝0.05。

2 結果

2.1 格隆溴銨對大鼠肺組織的影響 取各組大鼠肺組織進行病理組織學觀察，結果顯示，與對照組相比，模型組、干預組大鼠氣管周圍、血管周圍、肺間質周圍炎癥情況評分均明顯升高(P＜0.05)；與模型組相比，干預組大鼠氣管周圍、血管周圍、肺間質周圍炎癥情況評分均明顯降低(P＜0.05)；對照組大鼠肺組織結構正常，肺泡結構整齊且無融合現(xiàn)象，無炎性細胞浸潤，模型組大鼠的肺組織細胞有炎癥浸潤，出現(xiàn)肺泡融合現(xiàn)象，干預組大鼠肺組病理情況較模型組有緩解，見表1，見圖1。

圖1 格隆溴銨對大鼠肺組織的影響(×200)

表1 各組大鼠肺組織病理學情況比較(±s) 單位：分

表1 各組大鼠肺組織病理學情況比較(±s) 單位：分

注：與對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。

?組別 例數(shù) 氣管周圍 血管周圍 肺間質周圍對照組 10 0.20±0.02 0.21±0.04 0.24±0.05模型組 10 2.36±0.24a 1.97±0.13a 1.92±0.17a干預組 10 1.52±0.22ab 1.20±0.19ab 1.10±0.16ab F值 334.286 427.710 371.439 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 格隆溴銨對大鼠BALF中TNF-α、KC、GSH水平的影響 各組大鼠BALF中的TNF-α、KC、GSH檢測結果顯示，與對照組相比，模型組、干預組大鼠BALF中的TNF-α、KC含量均明顯升高(P＜0.05)，而GSH水平明顯降低(P＜0.05)；與模型組相比，干預組大鼠BALF中的TNF-α、KC含量均明顯降低(P＜0.05)，而GSH水平明顯升高(P＜0.05)，見表2。

表2 格隆溴銨對大鼠BALF中TNF-α、KC、GSH水平的影響(±s)

表2 格隆溴銨對大鼠BALF中TNF-α、KC、GSH水平的影響(±s)

注：TNF-α＝腫瘤壞死因子-α，KC＝角質形成細胞衍生趨化因子，GSH＝還原型谷胱甘肽；與對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。

?組別 例數(shù) TNF-α(pg/mL) KC(pg/mL) GSH(μg/mL)對照組 10 124.02±13.20 29.54±3.55 6.28±0.52模型組 10 329.51±26.44a 98.24±11.07a 2.46±0.23a干預組 10 167.33±13.37ab 53.18±6.22ab 4.97±0.41ab F值 334.599 210.225 230.043 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 格隆溴銨對大鼠BALF細胞計數(shù)的影響 對各組大鼠BALF液中細胞分類進行檢測，結果顯示，與對照相比，模型組與干預組BALF液中的細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比均明顯升高(P＜0.05)，而淋巴細胞百分比、單核細胞百分比均明顯降低(P＜0.05)；與模型組相比，干預組BALF液中的細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比均明顯降低(P＜0.05)，而淋巴細胞百分比、單核細胞百分比均明顯升高(P＜0.05)，見表3。

表3 格隆溴銨對大鼠BALF有核細胞計數(shù)的影響(±s)

表3 格隆溴銨對大鼠BALF有核細胞計數(shù)的影響(±s)

注：與對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。

組別 例數(shù) 細胞總數(shù)(106/mL) 單核細胞(%) 中性粒細胞(%) 淋巴細胞(%)對照組 10 1.76±0.14 86.24±5.33 2.41±0.18 11.35±1.15模型組 10 5.34±0.43a 70.32±6.01a 23.25±2.04ab 6.43±0.58ab干預組 10 2.52±0.21ab 78.24±6.94ab 13.02±1.29ab 8.71±0.86ab F值 429.332 16.868 556.094 75.827 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001?

2.4 格隆溴銨對大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1表達水平的影響 取各組大鼠肺組織用于MMP-9、TIMP-1表達水平檢測，Western blot檢測結果顯示模型組、干預組大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1蛋白水平均明顯高于對照組(P＜0.05)，干預組大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1蛋白水平均明顯低于模型組(P＜0.05)；RT-PCR檢測結果顯示模型組、干預組大鼠肺組織中MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA水平均明顯高于對照組(P＜0.05)，而干預組大鼠肺組織中MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA水平均明顯低于模型組(P＜0.05)，見表4，見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1蛋白水平凝膠成像結果

表4 格隆溴銨對大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1表達水平的影響(±s)

表4 格隆溴銨對大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1表達水平的影響(±s)

注：MMP-9＝基質金屬蛋白酶9，TIMP-1＝基質金屬蛋白酶抑制物-1；與對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。

組別 例數(shù) MMP-9 TIMP-1 MMP-9 mRNA TIMP-1 mRNA對照組 10 0.34±0.06 0.26±0.05 1.02±0.05 1.06±0.04模型組 10 0.87±0.06a 0.96±0.06a 2.01±0.08a 1.89±0.05a干預組 10 0.52±0.05ab 0.49±0.06ab 1.42±0.06ab 1.29±0.06ab F值 224.639 393.711 595.280 715.455 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001?

3 討論

慢阻肺氣流受限并以進行性的方式發(fā)展，吸入有害顆粒、吸煙是慢阻肺發(fā)病的重要因素。本研究通過LPS經氣管注入以及煙熏暴露用于慢阻肺大鼠模型制備，其肺組織病理結果顯示慢阻肺大鼠存在氣道炎癥反應，并且肺組織有損傷情況。慢阻肺主要治療藥物為支氣管擴張劑，抗膽堿能藥物也具有擴張支氣管作用。格隆溴銨為新研發(fā)長效抗膽堿能藥物，屬于長效季銨類毒蕈堿受體拮抗劑，其對人M3受體選擇性高于對人M2受體的選擇性。目前已有研究顯示格隆溴銨經人口吸入后5 min能夠達到血漿濃度峰值，90%被肺組織吸收，剩余被胃腸吸收，慢阻肺患者使用1周后，其藥代動力學保持穩(wěn)定[8]。慢阻肺確切病理機制尚未闡明，但炎癥反應、氧化應激在慢阻肺進展中具有重要作用[9]。慢阻肺氣道炎癥會刺激氣道上皮細胞分泌炎性因子，促進中性粒細胞、巨噬細胞聚集，加重氣道組織細胞損傷[10]。TNF-α能夠促進氣道黏液細胞黏液基因表達、呼吸爆發(fā)，加重氣道損傷程度，還可以通過刺激機體支氣管上皮細胞分泌IL-8[11]。IL-8可以通過促進T淋巴細胞、中性粒細胞聚集活化參與炎癥反應[12]。KC功能與人IL-8相似，能夠向呼吸道轉移、活化，加重氣道炎癥[13]。機體自由基的產生、消除在正常生理活動下處于動態(tài)平衡，GSH水平降低可使組織細胞易受氧化劑攻擊，其含量變化也顯示機體抗自由基能力[14]。本研究顯示格隆溴銨干預可以降低慢阻肺大鼠BALF中細胞總數(shù)、中性粒細胞所占百分比，升高淋巴細胞與單核細胞所占百分比。單淑香等[15]研究顯示噻托溴銨可以降低慢阻肺大鼠的中性粒細胞水平，本研究結果與前人研究結果相似，推測格隆溴銨對慢阻肺大鼠肺組織炎癥的改善作用，可能是通過調整慢阻肺大鼠肺組織中白細胞分類比例，影響炎性因子釋放，從而調節(jié)機體炎癥反應。

MMPs含量升高可以引起氣道外細胞外基質破壞，引起氣道重塑。慢阻肺促進巨噬細胞聚集、炎性因子分泌，刺激機體產生過多MMP-9，基質發(fā)生降解，影響氣道重塑。TIMP-1具有促進平滑肌細胞、成纖維細胞等細胞增生，促進平滑肌細胞間質、肌層增厚。正常生理狀態(tài)下MMP-9在肺組織呈微量表達，當受到刺激因素作用時，支氣管上皮細胞、纖維原細胞、平滑肌細胞及內皮細胞等細胞均能產生MMP-9，促進氣道重塑[16-17]。本研究結果顯示格隆溴銨可以降低慢阻肺大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1蛋白及基因表達量。張鵬飛等[18]研究顯示銀杏葉提取物可以通過降低MMP-9、TIMP-1蛋白水平，從而預防、減少慢阻肺大鼠肺組織重塑與纖維化。本研究結果與前人研究結果相似，推測格隆溴銨對慢阻肺大鼠肺組織的重塑有抑制作用，可能通過降低慢阻肺大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1表達水平實現(xiàn)。

綜上所述，格隆溴銨對慢阻肺大鼠的氣道炎癥有一定的改善作用，可能與調節(jié)炎性因子水平有關；還可以通過調節(jié)大鼠肺組織中的MMP-9、TIMP-1表達水平影響肺組織的重塑，實現(xiàn)對慢阻肺大鼠的肺組織保護作用。