TGF-β1誘導肝星狀細胞活化調控肝癌的炎癥和免疫反應

程變巧 黃志騰 林園香

原發性肝癌是嚴重危害人類健康的第4大惡性腫瘤之一，據世界衛生組織統計，每年仍有一定的比例發生[1-2]。目前研究認為肝癌的發生離不開炎癥和癌細胞的免疫逃逸[3]，慢性炎癥通過抑制免疫監測(immunosurveillance)來促進癌癥產生。因肝癌中常見原因是慢性乙型病毒性肝炎，因此提出沒有炎癥，就沒有腫瘤的假說。在我國，慢性乙型病毒性肝炎—肝硬化—肝癌仍是肝癌發生的三部曲。肝臟內的炎癥一般經過5年左右就會向肝硬化、肝癌的方向發展。其中炎癥可以啟動肝星狀細胞的活化[4-6]，后者可以引起肝硬化和肝癌。因此抑制肝星狀細胞的活化可望降低肝癌的發生。本課題通過改變肝星狀細胞與肝癌細胞共培養體系，觀察對肝癌的炎癥和免疫的影響，預期為肝癌的生物學治療提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人源LX-2及SMMC7721細胞株均由孟超肝膽醫院重點實驗室惠贈，本課題在本中心完成。用含有10%胎牛血清(ExCell FND500)+1%雙抗(Hyclone SV30010)的DMEM(Hyclone SH30022.01)高糖培養基，于37℃、5%CO2的培養箱中培養，根據生長情況進行傳代。

把LX-2肝星狀細胞系以3×105個/孔接種于六孔板中12 h后，加入10μg/L TGF-β1[4]24 h后，離心，收集上清液，并加入到預先生長率達60%的SMMC7721細胞中繼續培養48 h，加入Disitetide(HY-P0118)12 h后進行后續研究。

1.2 EILSA檢測 按照操作說明書，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測白細胞介素-8(IL-8)與白細胞介素-10(IL-10)的表達。取外周血2 000 rpm離心10 min，取上清液待檢。具體步驟如下，加樣：每個血清樣本設置3個孔，每孔加標準液100μL，37℃放置40 min；洗板：洗滌液洗4～6次，濾紙上印干(下同)；加蒸餾水25μL，一抗25μL，充分混勻后37℃放置20 min；洗板：同上；每孔加酶標抗體100 U 37℃放置10 min；洗板：同上；每孔加底物100μL于37℃暗處15 min；加100μL終止液混勻；30 min內在酶標儀450 nm處測吸光值(OD值)。

1.3 流氏細胞術 單細胞懸液制備：分別取SMMC7721、LX-2＋SMMCM7721、Disitetide+LX-2＋SMMCM7721細胞，進行胰酶終止消化、離心以及PBS洗滌后，棄去上清液，用PBS重懸細胞，調整細胞濃度為106/100μL，取100μL細胞進行實驗。表面染色：加入FITC標記抗人CD4、PE標記抗人CD25各20μL于上述細胞中，輕輕渦旋，4℃避光孵育30 min；胞內染色：每管加入1 mL 1xFix/Perm(破膜固定劑)工作液，渦旋3 s，避光4℃孵育40～50 min；再加入1 mL 1xPerm/Wash，350 g，4℃，離心6 min，棄上清液；每管加入100μL PBS重懸細胞；上流式細胞儀(BD FACSVerse)檢測CD4+、CD25+細胞比例。1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析。計量資料以(±s)表示，計量資料數據符合正態分布采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1誘導LX-2活化上調α-SMA表達

用10μg/L TGF-β1刺激LX-2細胞，用α-SMA的表達情況觀察LX-2的活化程度。結果發現，在用10μg/L TGF-β1組α-SMA基因和蛋白表達水平均較0μg/L TGF-β1表達水平高，且兩組間比較，P＜0.05。結果提示TGF-β1刺激LX-2細胞的活化。見圖1。

圖1 TGF-β1誘導LX-2活化后上調α-SMA表達。

2.2 活化的LX-2與SMMC7721細胞共培養促進肝癌的炎癥反應 活化的LX-2細胞和SMMC7721細胞共培養后，用肝星狀細胞抑制劑Disitetide處理共培養細胞，觀察LX-2對SMMC7721炎癥反應的影響，結果見表1。在共培養細胞內IL-8與IL-10表達水平均呈現上調表達，與SMMC7721比較，P均＜0.05。隨后用TGF-β1抑制劑Disitetide處理共培養細胞，隨后發現IL-8與IL-10表達水平均呈現下調表達，三組間比較，P均＜0.05。這說明肝星狀細胞的活化程度調控著肝癌的炎癥反應。

表1 炎癥介質在活化的LX-2與SMMC7721共培養體系中表達(±s) 單位：μmol/L

表1 炎癥介質在活化的LX-2與SMMC7721共培養體系中表達(±s) 單位：μmol/L

注：IL-8和IL-10組各組間比較，P＜0.05。

項目 SMMC7721 LX-2+SMM C7721 干預組 F值 P值?IL-8 21.83±0.42 41.50±1.43 25.44±0.93 318.72＜0.001 IL-10 19.2±0.29 24.99±0.11 21.65±0.33 368.32＜0.001

2.3 活化的LX-2和SMMC7721細胞共培養可以促進肝癌的免疫反應 活化的LX-2細胞和SMMC7721細胞共培養后，用肝星狀細胞抑制劑Disitetide處理共培養細胞，流式細胞術觀察CD4+CD25+T細胞處理前后的表達變化。結果見圖2，在共培養細胞中CD4+CD25+T細胞(1.57%)較SMMC7721細胞中表達(0.46%)明顯增加(P＝0.003)；在Disitetide干預后表達稍有下降(1.2%)，與共培養組比較，P＝0.025；與SMMC7721組比較，P＝0.130。從上述結果表明，活化的LX-2細胞可以上調SMMC7721細胞的免疫活性。

圖2 活化的LX-2和SMMC7721細胞共培養后上調CD4+CD25+T細胞的表達

3 討論

腫瘤微環境(TME)是腫瘤細胞賴以生存和發展的復雜環境，而HCC的慢性炎癥是復雜的腫瘤微環境的重要組成成分之一，其中包括炎癥/免疫細胞和介質。因此推測，HCC轉移的生物學行為和惡性預后可能被局部的炎癥狀態所決定。最近越來越多的證據也提示，在肝癌形成過程中，炎癥/免疫細胞活化，并相互協作，獲得促瘤活性，從而導致腫瘤的惡性后果。在這些成分中肝星狀細胞(HSCs)是免疫微環境中不可或缺的一種炎癥細胞，HSC的活化，引起一些活化信號分子如：轉化生長因子(TGF)-β、肝細胞生長因子(HGF)和血小板源性生長因子(PDGF)的表達增加，在腫瘤發展和纖維化過程中起到重要作用。與各種免疫活性細胞和腫瘤細胞相互作用，發揮其促瘤作用[7-8]。

優化微環境或可暫緩肝癌必死之局[9]。如何調控肝癌的腫瘤微環境是目前研究的熱點和重點?；贖SC在肝癌中的作用特點，本課題通過調控HSC的活性表達來觀察肝癌微環境中炎癥和免疫變化。根據前期實驗結果，我們首先用TGF-1誘導LX-2的活化，進而對活化的LX-2細胞進行血清收集，進而與SMMC7721細胞進行共培養。分別用流式細胞術和ELISA技術觀察了共培養體系中LX-2對SMMC7721炎癥免疫的改變情況。IL-8和IL-10是巨噬細胞和上皮細胞等分泌的細胞因子，主要調節細胞的生長與分化，參與炎性反應和免疫反應，是目前公認的炎癥與免疫抑制因子。研究認為CD4+、CD25+調節性T細胞主要抑制腫瘤細胞的免疫反應，引起腫瘤細胞逃避機體的免疫監視，從而促進腫瘤的發生和發展[10-12]。我們課題組研究結果發現，在LX-2刺激的共培養組，IL-8和IL-10的表達水平均較SMMC7721肝癌細胞組表達上調，CD4+、CD25+調節性T細胞在淋巴細胞中比例也明顯升高。為了進一步探討LX-2對SMMC7721的調控機制，我們用TGF-β1抑制劑Disitetide處理共培養細胞，目的是抑制LX-2的活化觀察共培養體系中炎癥免疫的改變。結果發現，干預后的IL-8和IL-10的表達水平較干預前表達下降，較SMMC 7721肝癌細胞組表達下調不顯著(P＝0.130)，CD4+、CD25+調節性T細胞在淋巴細胞中比例較共培養組也明顯下降。這說明阻斷TGF-β1信號通路可能是阻斷Treg功能以增強抗腫瘤反應的有效策略[13-15]。從上述結果中初步說明活化的LX-2細胞對肝癌細胞SMMC7721具有顯著的促進炎癥反應的提高免疫抑制作用，從而影響著肝癌的侵襲和轉移等生物學行為。

基于上述的研究結果，我們已經明確肝癌體內存在免疫和炎癥發應，HSC活化對肝癌的上述機制具有促進作用。但活化的HSC是如何調控肝癌微環境中的炎癥和免疫的，對肝癌增生、凋亡、侵襲和轉移的作用機制不明。下一步有望對肝癌炎癥和免疫的調控機制的研究來揭示肝癌發生發展的生物學功能。