隴南地區(qū)丙型肝炎病毒感染的基因型研究＊

周 輝，焦文學(xué)，葉芳紅，王 潔

（甘肅省隴南市第一人民醫(yī)院，甘肅 隴南 746000）

丙型肝炎病毒（HCV）是一種通過(guò)血液或者體液進(jìn)行傳播的傳染性病毒，發(fā)病癥狀不明顯，如果診斷不及時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響患者的肝臟功能，導(dǎo)致肝臟部分組織出現(xiàn)炎癥或者纖維化的現(xiàn)象，最終發(fā)展為肝硬化和肝癌[1]。目前，臨床上已經(jīng)將HCV 歸類(lèi)為損傷肝臟功能重要因素之一。通過(guò)對(duì)HCV 進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)HCV 基因型和患者病情發(fā)展、臨床癥狀、藥物敏感度、傳播方式等都有著較為緊密的關(guān)系[2]。有報(bào)道稱(chēng)基因分型的不同會(huì)增加肝硬化或者肝癌的發(fā)生概率，基因型和血清抗體相遇后所產(chǎn)生的反應(yīng)也有所差異[3]。HCV 基因型可以成為制定治療方案的主要標(biāo)準(zhǔn)，且可以讓醫(yī)生更加清晰地了解HCV 傳播途徑，對(duì)于HCV 的治療和預(yù)防都有著重要的意義。隴南地區(qū)交通和經(jīng)濟(jì)發(fā)展均較為落后，人口在287 萬(wàn)左右，隴南市中心血站及各縣級(jí)醫(yī)院，只能進(jìn)行抗HCV 篩查，對(duì)HCV 基因型研究較少[4]。為了提高隴南地區(qū)HCV 治療效果和預(yù)后效果，選擇2013 年10 月—2015 年10 月隴南地區(qū)HCV患者作為研究樣本，具體研究?jī)?nèi)容如下。

1 資料與方法

1.1 基本資料

選擇2013 年10 月—2015 年10 月期間隴南市第一人民醫(yī)院所收治丙型肝炎患者共69 例作為研究對(duì)象，經(jīng)疾病診斷患者共32 例，年齡在34～82歲，平均年齡（68.34±3.42）歲，男15 例，女17 例。未經(jīng)疾病診斷患者37 例，均為男性，年齡在18～45歲，平均年齡（30.42±3.89）歲。經(jīng)比較，69 例患者基本資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 方法

提取HCV、RNA

（1）抑制物去除液（濃縮液）以及去離子液（濃縮液）分別加入2.5 mL、11 mL 無(wú)水乙醇，并做好標(biāo)記，室溫保存。蛋白酶K（干粉）以及Carrier RNA（干粉）中加入625 μL 洗脫液，充分混勻溶解，放置于-20℃環(huán)境下保存。

（2）處理標(biāo)本。血清標(biāo)本、血漿標(biāo)本和陰陽(yáng)性質(zhì)控品處理方法一致。取滅菌1.5 mL 離心管加入50 μL RNA 蛋白酶K，取200 μL 血清或血漿，加入200 μL 病毒裂解液（已含Carrier RNA），振蕩混勻，高速離心10 s，72 ℃放置10 min。同時(shí)將洗脫液置于72℃預(yù)熱。加入250 μL 無(wú)水乙醇，振蕩混勻，將混合液吸至離心柱、500 μL 抑制物去除液以及500 μL 去離子液加入離心柱，室溫下12 000 rpm 離心1 min，將離心柱裝至新的收集管。重復(fù)操作后將離心柱-收集管于室溫下14 000 rpm 離心3 min 除去殘余乙醇，將離心柱取出，放置于新的1.5 mL 離心管。打開(kāi)離心柱蓋子，72 ℃放置2 min，在離心柱的膜的正上方加入72 ℃預(yù)熱的洗脫液50 μL，蓋緊離心柱管蓋,室溫靜置1 min 后，14 000 rpm 離心1 min。離心管內(nèi)即為病毒核酸溶液，建議立即使用，如需保存，置于-20 ℃[5]。

RT-PCR 擴(kuò)增：HCV-PCR 反應(yīng)管若干，分別在管壁加入標(biāo)本和陰陽(yáng)性質(zhì)控品RNA 各30 μL，瞬時(shí)離心，將各反應(yīng)管放入PCR 儀，按下列條件擴(kuò)增：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄25 min，95 ℃15 min 預(yù)變性，然后按（94 ℃30s→55 ℃40 s→72 ℃45 s）×45 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增；最后72 ℃延伸7 min[6]。

雜交反應(yīng)：正確配置試劑，包括雜交液Ⅰ濃縮液、雜交液Ⅱ濃縮液、溶液Ⅱ濃縮液、溶液Ⅳ、顯色液。利用DA-8000 全自動(dòng)核酸分子雜交儀實(shí)施核酸檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)比兩組患者基因分型情況

兩組患者中基因分型為3a 的患者數(shù)量最多，第一批次患者中8 例患者未分型，第二批次患者中1 例患者分型結(jié)果為陰性，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 兩批次患者基因分型（n，%）

2.2 病情與基因型關(guān)系

3a 型和1b 型患者普遍病情較為嚴(yán)重，包括肝硬化、腹痛、肝癌、消化道出血等，患者臟器功能受到嚴(yán)重影響，具體對(duì)比數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，P<0.05。

表2 病情與基因型關(guān)系（n，%）

3 討論

丙型肝炎病毒屬于一種傳染性病毒，目前，HCV患者數(shù)量正在持續(xù)增加，如何預(yù)防和控制HCV 的傳播和擴(kuò)散已經(jīng)成為了世界各國(guó)所面臨的重要問(wèn)題之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織對(duì)HCV 患者進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，每年均有300 萬(wàn)左右人次被HCV 所感染[7-11]。HCV治療難度較大，難以徹底從血液之中根除，且會(huì)損害患者的肝臟功能，隨著疾病不斷發(fā)展，會(huì)形成肝硬化或者癌癥。部分患者雖然被HCV 所感染，但是并不會(huì)表現(xiàn)出相應(yīng)的癥狀，會(huì)成為攜帶HCV 的人群，通過(guò)某些途徑可能會(huì)將病毒傳染給其他人。HCV 基因分型具有一定的地理特征，我國(guó)多數(shù)HCV 患者為1b 型和2a 型，但是，每個(gè)地區(qū)基因分型差異性較大，在研究HCV 治療和預(yù)防時(shí)應(yīng)當(dāng)結(jié)合地區(qū)實(shí)際基因分型情況進(jìn)行研究。HCV 患者基因型的不同會(huì)影響到臨床癥狀表現(xiàn)以及病情發(fā)展的嚴(yán)重程度，而且每一種基因?qū)τ谥委熕幬锏拿舾谐潭纫灿兄^大的差異[12-13]。對(duì)HCV 基因分型進(jìn)行分析可以結(jié)合患者的具體分型制定合適的治療方案，認(rèn)識(shí)到不同類(lèi)型的HCV 分型和肝臟疾病的嚴(yán)重程度，預(yù)測(cè)治療效果，提高HCV 治療水平[14-15]。

根據(jù)本次研究結(jié)果進(jìn)行分析，隴南地區(qū)3a 型HCV 患者所占比例最多，其次分別為1b、6a、2a、3b，且基因型為3a 型和1b 型患者容易發(fā)展為肝硬化以及肝癌，嚴(yán)重?fù)p害了患者的肝臟功能。因此，隴南地區(qū)在今后對(duì)HCV 患者實(shí)施治療時(shí)，應(yīng)在3a 型患者治療方案中增加預(yù)防肝硬化、肝功能受損的計(jì)劃，加強(qiáng)對(duì)患者肝臟功能的保護(hù)。

綜上所述，通過(guò)對(duì)隴南地區(qū)丙型肝炎患者基因型進(jìn)行分析，3a 型患者比例逐漸增加，且3a 型HCV患者普遍存在肝功能受損問(wèn)題，部分患者已經(jīng)出現(xiàn)癌化現(xiàn)象，嚴(yán)重威脅了隴南地區(qū)人民身體健康。本次研究過(guò)程中所選擇的樣本數(shù)量不足，會(huì)對(duì)此次研究活動(dòng)的結(jié)果造成一定的影響，在之后臨床治療過(guò)程中應(yīng)持續(xù)關(guān)注臨床數(shù)據(jù)的變化，強(qiáng)化隴南地區(qū)HCV 治療效果和控制水平。