植物不飽和脂肪酸對肺癌細胞毒性作用＊

俞 蕾，謝明仁，俞發榮

（1.甘肅政法大學圖書館；2.甘肅政法大學公安分院，甘肅 蘭州 730070）

近年來，隨著脂肪酸研究的不斷深入，人們已經認識到，不飽和脂肪酸是人體必需的重要的營養物質[1]。不飽和脂肪酸對于維持人體健康[2]、提高腫瘤患者的免疫功能[3]、改善營養狀態[4]起著重要的促進作用。有的不飽和脂肪酸具有明顯的細胞毒性[5]。在肺癌研究中發現，下調蛋白激酶B（PKB/Akt）活性[6]，降低P53 表達[7]，可抑制肺癌細胞增生，促進其凋亡[8]。據甘肅省最新腫瘤登記年報報道，甘肅省腫瘤發病率已經達到240 人/10 萬，其中肺癌發病率均高于全國平均水平，其發病率和病死率一直居高不下，嚴重影響著地方經濟的發展，威脅著人們的身心健康。為了尋找預防和治療腫瘤的天然藥物，減輕藥物對病人的毒副作用，選用從甘肅貓兒眼（Euphorbia kansui）塊根中提取分離出的不飽和脂肪酸（Unsaturated Fatty Acid，UFA），給予肺癌（SHG-44）細胞，探索不飽和脂肪酸對肺癌細胞毒性作用，為不飽和脂肪酸進一步研究開發和臨床應用提供理論依據，也為預防和治療肺癌探索新的作用靶點，提供新的藥物資源。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA），蘭州大學化工學院提供；氟尿嘧啶（5-FU），武漢制藥集團股份有限公司生產；臺盼藍、噻唑蘭、二甲基亞砜（DMSO），上海信乎生物科技有限公司；P21、P53、PKB/Akt試劑盒，SHANGHAICRTSTAL DAY BIOTECH CO.，LTD.，酶聯檢測儀，賽默飛世爾儀器有限公司。

1.2 人肺癌細胞株（SHG-44）

甘肅省醫學科學研究院藥理室提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 UFA 對肺癌細胞毒性實驗

取肺癌細胞培養液（2×106個/L）加入96 孔板，每孔90 μL。UFA 組：用DMSO 稀釋成0.2、0.4、0.8 mg/L 三個組，每組每孔分別加10 μL；5-FU 組：加5-FU（10 mg/L）每孔10 μL；對照組：每孔加DMSO（30 μL/L）10 μL。各組4 孔。培養至6、12、18、24、48 h 時各取1 板，每孔加0.4%臺盼藍10 μL，統計活細胞數，取平均數作圖。

1.3.2 UFA 對肺癌細胞增殖的抑制作用

培養48 h，每孔加噻唑蘭10 μL，培養4 h，每孔加二甲基亞砜100 μL，振蕩10 min，檢測其吸光度，計算抑制率。

1.3.3 UFA 對肺癌細胞分裂周期的影響

取肺癌細胞液（細胞密度為2×105個/L）加入細胞培養瓶（含RPMI1640 培養液6 mL），每瓶2 mL，UFA 組分別加入0.2、0.4、0.8mg/LUFA，每瓶0.8 mL；5-FU 組：每瓶加5-FU 0.8 mL；對照組:每瓶加二甲基亞砜0.8 mL。培養48 h，離心，用流式細胞儀測定各期細胞數和凋亡率。

1.3.4 UFA 對肺癌細胞P21、P53、PKB/Akt 表達的影響

取0.2、0.4、0.8 mg/L 不飽和脂肪酸培養48 h 的SHG-44 細胞，按ELISA 檢測P21、P53、PKB/Akt 表達水平。

1.3.5 直線回歸方程制作

分別取不同濃度標準品50 μL 加入酶標板，在450 nm 波長下測定吸光度（OD）。以標準品濃度為橫坐標，對應吸光度（OD）為縱坐標做出標準曲線直線回歸方程。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對實驗數據進行統計學分析。計數資料用百分率（%）表示，組間比較用單因素方差分析，用均數±標準差（）表示，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UFA 對肺癌細胞毒性作用

給予肺癌細胞0.2、0.4、0.8 mg/L UFA 和5-FU 培養6、12、18、24 和48 h，活細胞數依藥濃度的升高和培養時間的延長而減少，培養到48 h，活細胞數比對照組減少80.86%、85.75%、91.79%和86.58%，差異有顯著性（P<0.01）（圖1）。

圖1 UFA 對肺癌細胞毒性作用(與對照組比：＊＊P<0.01)

2.2 UFA 對肺癌細胞的抑制作用

給予肺癌細胞0.2、0.4、0.8 mg/L UFA 和5-FU培養48 h，MTT 法檢測，肺癌細胞增殖抑制率為50.62%、54.88%、82.36%和44.47%（圖2）。

圖2 UFA 對肺癌細胞增殖的抑制作用(與對照組比：＊＊P<0.01)

2.3 UFA 對肺癌細胞分裂周期的影響

給予肺癌細胞0.2、0.4、0.8 mg/L UFA 和5-FU 培養48 h，G0G1 期細胞比對照組增加21.37%、30.04%、35.89%和23.39%；G2M 期細胞比對照組減少13.70%、55.40%、64.06%和51.25%；細胞凋亡率為16.34%、18.28%、21.41%和17.21%（表1）。

表1 UFA 對肺癌細胞分裂周期和凋亡的影響

2.4 UFA 對肺癌細胞P21 表達的影響

P21 直線回歸方程（圖3）。將肺癌細胞OD 代入方程，計算出0.2、0.4、0.8 mg/L UFA 組和5-FU 組肺癌細胞P21 水平比對照組升高11.76%、26.17%、38.58%和34.48%（圖4）。

圖3 P21 標準品直線回歸方程

圖4 肺癌細胞P21 表達水平

2.5 UFA 對肺癌細胞P53 表達的影響

P53 直線回歸方程（圖5）。將肺癌細胞OD 代入方程，計算出0.2、0.4、0.8 mg/L UFA 組和5-FU 組P53 水平比對照組降低17.47%、43.08%、88.11%和75.82%（圖6）。

圖5 P53 標準品直線回歸方程

圖6 肺癌細胞P53 表達水平

2.6 UFA 對肺癌細胞PKB/Akt 表達水平的影響

PKB/Akt 直線回歸方程（圖7）。將肺癌細胞OD代入方程，計算出0.2、0.4、0.8 mg/L UFA 組和5-FU 組PKB/Akt 水平比對照組降低9.68%、19.29%、38.78%和30.76%（圖8）。

圖7 PKB/Akt 標準品直線回歸方程

圖8 肺癌細胞PKB/Akt 表達水平

3 討論

目前，癌癥治療主要采用外科、放療、化療、中醫藥及綜合治療等方法。許多研究表明，中藥配合放療、化療不但可以減輕其不良反應，對腫瘤的療效也有明顯提高[9]。不飽和脂肪酸具有誘導多種腫瘤細胞凋亡[10]、抑制腫瘤細胞增殖[11]、轉移[12]等作用，并能抑制相關癌癥基因編碼蛋白表達[13]，調控信號傳導通路[14]，降低癌細胞的侵襲力[15]，起到抗腫瘤的作用。高等動物乃至人類組織細胞的正常生長受到不同信號轉導系統的調控，其中磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號轉導通路與細胞分裂增殖關系尤為密切[16]。Zou 等[17]研究發現，細胞生長或抑制受PI3K-Akt 信號轉導通路的調節和控制，PI3K-Akt 信號轉導通路在細胞內發揮重要的作用，參與了許多生理和病理活動。體外研究顯示，采用PI3K-Akt 信號轉導通路抑制劑可以逆轉腫瘤細胞的耐藥性[18]和提高抗腫瘤藥物的藥效[19]，PI3K-Akt 信號轉導通路可能是腫瘤治療的一種有效的目標[20]。PI3K-Akt 信號轉導通路在組織血管生成和細胞生長、增殖、新陳代謝、遷移、分化和凋亡過程中起著至關重要的作用[21]。PI3K-Akt 信號轉導通路被激活時，促進細胞增殖[22]；PI3K-Akt 信號轉導通路被抑制時，促進細胞凋亡，發揮其抑制細胞增殖效應[23]。細胞信號轉導通路參與了人類腫瘤的發生、發展、浸潤和轉移過程，研究PI3K-Akt 信號轉導通路和參與機制及PI3K 蛋白表達，對腫瘤診斷治療和預后判斷具有一定的參考價值[24]。PI3K-Akt 信號轉導通路不僅與細胞的增殖和凋亡有關，而且在腫瘤的生長、對化療的反應方面都扮演著重要角色，特異性抑制PI3K-Akt 信號轉導通路的活性可減少腫瘤細胞的化療耐藥性[25]。Zhong 等[26]將二氫青蒿素（DHA）給予腫瘤細胞，通過抑制PI3K-Akt 信號轉導通路的活化，使細胞阻滯于G0/G1 期，明顯抑制了腫瘤細胞的增殖，提示PI3K-Akt 信號轉導通路可作為腫瘤治療的潛在靶點。在PI3K-Akt 信號轉導通路中，P53、P21 基因起著重要的調控作用。正常生理條件下，體內外環境因子與細胞膜受體結合，激活P53基因使之表達，P53 蛋白與P21 基因直接作用調控P21 蛋白的表達，促使P21 與GDP 分離而與GTP 結合，形成P21-GTP 復合體，使細胞內信號轉導系統開放，細胞開始分裂和增殖；P21 具有GTP 酶活性，可水解GTP 為GDP，P21 與GDP 結合而失活，使細胞內信號轉導系統處于關閉狀態。綦霞等[27]對46 例首次確診的肺癌患者和23 例健康體檢者（對照組）血清中肺癌P53 等7 種抗體檢測發現，肺癌組患者抗體的陽性率明顯高于對照組。凌智君等[28]選取80例肺部疾病良性患者作為良性組，另取80 例健康人士作為對照組，對80 例非小細胞肺癌患者臨床醫學資料進行分析對比各組血清P53 相關檢測指標。比較結果，80 例非小細胞肺癌患者中P53 陽性表達占57.5%，與患者的淋巴結轉移、腫瘤分化程度以及腫瘤大小有關（P<0.05）。P53 抗體能夠為非小細胞肺癌患者的淋巴結轉移、腫瘤分化程度等病情的發展提供參考意義，具有較好的特異性。李慧等[29]將中藥小青龍湯給予肺癌大鼠28 d，PCR 法和流式細胞術檢測肺細胞P53 表達水平顯著降低（P<0.05），肺細胞凋亡率均顯著升高（P<0.05）。吳傳高等[30]給予肺癌H322 細胞2Gy 劑量照射后，H322 細胞P53 蛋白表達水平明顯下降，G0G1 期細胞增加，G2M 期細胞明顯減少。劉玉梅等[31]利用天然活性物質抑制PKB/Akt 表達，誘導細胞凋亡，從而發揮抗腫瘤效應。臺盼藍是組織和細胞培養中最常用的死細胞鑒定染色方法之一。正常的活細胞膜結構完整，能夠排斥臺盼藍，使之不能夠進入胞內，而喪失活性或細胞膜不完整的細胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色。若細胞膜完整性喪失，即可認為細胞已經死亡。因此，借助臺盼藍染色可以非常簡便、快速地區分活細胞和死細胞。MTT 法是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。臺盼藍和MTT 實驗發現，給予肺癌細胞不飽和脂肪酸，活細胞數依給藥濃度的增加和培養時間的延長明顯減少，肺癌細胞抑制率顯著升高。肺癌細胞P21 水平升高，使線粒體跨膜電位降低，線粒體內外膜之間的通透性轉換孔開放，導致線粒體膜通透性增大，使細胞凋亡的啟動因子細胞色素C 從線粒體內釋放出來，導致細胞凋亡。PKB/Akt、P53 水平降低，抑制細胞分裂周期，G0G1期細胞明顯增加，G2M 期細胞顯著減少，肺癌細胞凋亡率升高。實驗結果與上述文獻結果一致。

綜上所述，植物提取不飽和脂肪酸對肺癌細胞具有明顯的毒性作用。其機制與不飽和脂肪酸破壞細胞膜結構，損傷線粒體，誘導細胞凋亡，升高肺癌細胞P21 表達水平，降低PKB/Akt、P53 水平，抑制細胞分裂周期有關。P53、P21、PKB/Akt 可作為臨床肺癌治療的潛在靶點。