糞便脫落細胞BMP3與BCAT1基因甲基化檢測對結腸癌及癌前病變篩查的價值

李紅海，張曉鈿，房一鳴，吳俊梅

結腸癌作為結腸黏膜上皮惡性腫瘤，侵襲性強、預后差，發現時大多已至晚期，及早發現可及早治療，對于提高生存率及改善預后具有重要意義[1]。結腸癌目前的主要檢測方法為腸鏡檢測，但為侵入性檢測，創傷大，且可能造成一些并發癥[2]，對患者造成一定的傷害。若能尋找到一種依從性高、診斷價值高且經濟的非創傷性篩查手段，則可提高結腸癌甚至癌前病變檢出率，對于疾病防治有重要意義。糞便樣本取樣簡單、無創、有較好的操作性和重復性，且糞便中含有脫落和游離的癌細胞DNA，有望成為結腸癌篩查方法[3]。DNA異常甲基化是腫瘤中常見的表觀遺傳學改變，其中骨形態發生蛋白3(bone morphogenetic protein 3，BMP3)基因常發生高頻甲基化，且已成為腫瘤標志物用于結腸癌篩選[4]。甲基化通過多種酶實現，支鏈氨基酸氨基轉移酶1(branched-chain amino acid transferase-1，BCAT1)作為啟動氨基酸代謝的關鍵酶，在結腸癌診斷中亦有一定價值[5]。但單個基因診斷價值有限，目前尚未發現BMP3、BCAT1及二者聯合檢測診斷結腸癌相關研究，為提高結腸癌及癌前病變的檢出率，本研究檢測糞便脫落細胞BMP3、BCAT1甲基化情況，為臨床上結腸癌及癌前病變預測提供一定試驗依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2020年2—12月海南醫學院第一附屬醫院胃腸腫瘤外科患者94例糞便樣本，患者均經結腸鏡檢查或術后病理切片確診，糞便樣本在腸鏡檢查前或手術前收集，置于-80℃冰箱保存。其中結腸癌患者43例(結腸癌組)、結腸腺瘤患者19例(結腸腺瘤組)、單純痔瘡患者32例(對照組)。結腸癌組男21例，女22例，年齡45～70(53.78±4.65)歲；心率68～81(76.33±3.17)次/min；呼吸頻率16～20(18.49±1.20)次/min；結腸腺瘤組男11例，女8例，年齡46～71(54.06±5.81)歲；心率66～80(76.31±3.91)次/min；呼吸頻率15～21(18.43±1.24)次/min。對照組男17例，女15例，年齡46～70(53.19±4.49)歲；心率67～83(76.49±3.47)次/min，呼吸頻率17～22(18.38±1.18)次/min。3組性別、年齡、心率、呼吸頻率比較差異無統計學意義(χ2/P=0.453/0.798，F/P=0.227/0.797、0.025/0.975、0.078/0.925)。本研究經醫院倫理協會審核并通過(審批號：HYLL-2019-190)，符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》要求。患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：無家族遺傳史患者。(2)排除標準：①伴有其他部位惡性腫瘤者；②樣本采集前進行手術或放、化療患者；③臨床資料不完整者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 臨床/病理特征：收集結腸癌患者的臨床/病理特征，包括性別、年齡，臨床分期、腫瘤最大徑、腫瘤體積、分化程度、淋巴結轉移、浸潤程度情況等。

1.3.2 BMP3、BCAT1基因甲基化檢測：自-80℃冰箱中取出糞便，隨機編號，每個樣本稱量200 mg提取脫落細胞基因組DNA，嚴格按照磁珠法糞便脫落細胞基因組DNA提取試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號 WH0114-YNH)說明書進行。甲基化特異性PCR(MSP)檢測BMP3、BCAT1甲基化，PCR引物由寶日醫生物技術(北京)有限公司合成。首先進行PCR擴增，反應條件：95℃ 10 min；95℃ 30 s、61℃ 30 s、72℃ 30 s，40個循環。經瓊脂糖凝膠電泳，若擴增出大小為142 bp的片段，則DNA提取成功。采用亞硫酸氫鹽轉化試劑盒(德國Qiagen公司)修飾DNA，用MSP技術檢測檢測DNA甲基化情況，BMP3甲基化上游引物：5’-GTTTGGAGTTTAATTTTCGGTTTC-3’，下游引物：5’-ATAACTTCGATCTCTCTCCCTACG-3’(擴增長度179 bp，退火溫度54℃)；BMP3非甲基化上游引物：5’-GGTTTGGAGTTTAATTTTTGGTTTT-3’，下游引物：5’-AACTTAATCTCTCTCCCTACACC-3’(擴增長度178 bp，退火溫度54℃，位于第3外顯子區)。BCAT1甲基化上游引物：5’-GGTCCCATATTCAACATCTGC-3’，下游引物：5’-CACCTTTCCAGGCTCTTACA-3’(擴增長度197 bp，退火溫度58℃)；BCAT1非甲基化上游引物：5’-TATTTGACAAAGAAGAGCTC-3’，下游引物：5’-ACTTGAAAAATCCGGTCCCA-3’(擴增長度196 bp，退火溫度60℃，位于第4、5外顯子區)。經瓊脂糖凝膠電泳，甲基化判定標準：出現甲基化條帶即為甲基化，僅出現非甲基化條帶即為非甲基化。二者聯合檢測結果陽性判定標準：只要一個基因甲基化陽性即判定該樣本陽性。

2 結 果

2.1 3組患者糞便脫落細胞BMP3、BCAT1基因甲基化陽性率比較 糞便脫落細胞BMP3、BCAT1單基因及二者聯合基因甲基化陽性率比較，結腸癌組>結腸腺瘤組>對照組(P均<0.01)，見表1。BMP3、BCAT1基因甲基化典型瓊脂糖凝膠電泳圖，見圖1。

表1 3組患者糞便脫落細胞BMP3、BCAT1單基因及二者聯合基因甲基化陽性率比較 [例(%)]

注：S.樣品；M.甲基化；U.非甲基化；Positive.陽性對照；Negative.陰性對照；BMP3與BCAT1中S1～S3樣品隨機選取圖1 3組患者糞便脫落細胞BMP3、BCAT1甲基化狀態

2.2 結腸癌患者糞便脫落細胞BMP3與BCAT1聯合基因甲基化在不同臨床病理特征中比較 糞便脫落細胞BMP3與BCAT1聯合基因甲基化與非甲基化結腸癌患者淋巴結轉移情況、浸潤程度比較差異無統計學意義(P>0.05)，而甲基化患者腫瘤最大徑、腫瘤體積大于非甲基化患者(P<0.01)，分化程度越低、臨床分期越高基因甲基化陽性率越高，并高于非甲基化患者(P<0.05)，見表2。

表2 結腸癌患者糞便脫落細胞BMP3與BCAT1聯合基因甲基化陽性在不同臨床病理特征中比較 [例(%)]

2.3 糞便脫落細胞BMP3、BCAT1單基因及二者聯合基因甲基化對結腸腺瘤的診斷價值 ROC曲線結果顯示，BMP3基因甲基化(AUC 0.579，95%CI0.433～0.716)、BCAT1基因甲基化(AUC 0.521，95%CI0.377～0.663)、二者聯合基因甲基化(AUC 0.574，95%CI0.428～0.711)的AUC比較，差異無統計學意義(Z=0.052，P=0.959)。

2.4 糞便脫落細胞BMP3、BCAT1單基因及二者聯合基因甲基化對結腸癌的診斷價值 ROC曲線結果顯示，BMP3基因甲基化(AUC 0.701，95%CI0.585～0.802)、BCAT1基因甲基化(AUC 0.744，95%CI0.630～0.838)、二者聯合基因甲基化(AUC 0.852，95%CI0.752～0.924)的AUC比較，BMP3與BCAT1聯合基因甲基化的AUC最高(Z=3.598，P=0.000)，見表3。

表3 糞便脫落細胞BMP3、BCAT1單基因及二者聯合基因甲基化陽性對結腸腫瘤的診斷價值比較

3 討 論

結腸癌發病率及病死率在惡性腫瘤中均排名第三位，在過去10年里，盡管對其診斷和治療取得較大進步，但結腸癌患者5年生存率仍僅為50%～65%[6-7]。結腸癌的發病率高，且預后不良，是世界衛生組織公布的公共衛生問題[8]，目前亟需解決。尋找能夠及早診斷疾病的基因并予對應治療對于改善預后具有較高價值。本研究中以94例患者糞便樣本為研究對象，探討單純痔瘡、結腸腺瘤、結腸癌患者糞便脫落細胞中BMP3、BCAT1基因甲基化情況，為臨床上早期發現疾病提供一定參考依據。基因甲基化是在不改變DNA序列前提下，引起染色體構象、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質的相互作用方式發生改變，從而控制基因表達，改變表觀遺傳現象[9]。已有研究表明，基因甲基化有望成為早期診斷多種惡性腫瘤的生物學標志物，包括食管癌、肺腺癌以及結腸癌等[10-12]。

BMP3屬轉化生長因子β家族一員，可誘導細胞分化，促進骨、軟骨發育[13]；在腫瘤中參與腫瘤形成過程，能夠影響淋巴結轉移、腫瘤惡性程度和預后狀況[14]。在本研究中發現，BMP3甲基化在結腸癌糞便脫落細胞中呈高表達狀態，且對結腸癌有一定診斷價值，已發現BMP3在結腸癌中起抑癌作用，抑癌基因失活主要機制是啟動區甲基化，BMP3的高甲基化對BMP3的表達具有抑制作用，可造成基因功能失活，導致腫瘤的形成，對于篩查結腸癌具有較大潛力[15-17]。BMP3甲基化升高可能抑制BMP3的表達，從而使BMP3的抑癌作用降低，間接促進癌癥的發生。BCAT1又名ECA39基因，是催化支鏈氨基酸代謝的一種關鍵酶，可催化支鏈α-酮酸至支鏈L-氨基酸的可逆轉反應，從而影響細胞生長，此外，BCAT1還參與細胞周期調控、細胞增殖、凋亡、分化過程[18-20]；在本研究中尚未發現單純痔瘡患者中BCAT1甲基化情況，在結腸腺瘤、結腸癌中發現BCAT1甲基化，且對結腸癌有一定診斷價值。已發現BCAT1甲基化在結直腸癌中與癌癥復發狀況關系密切，已成為特定的生物標志物[21]。提示BCAT1作為結腸癌新晉腫瘤標志物，若檢測出現甲基化則患者患結腸腺瘤、結腸癌的幾率增加。

進一步研究發現，BMP3、BCAT1二者聯合基因甲基化對結腸癌有較高的診斷價值。基因甲基化在多數情況下可以調控遺傳信息的表達，影響轉錄因子與其DNA靶位點的結合，改變靶基因的表達，是腫瘤發生的驅動因素[22-24]。分析結腸癌患者BMP3、BCAT1二者聯合基因甲基化與臨床病理資料關系發現，結腸癌患者糞便脫落細胞BMP3與BCAT1聯合基因甲基化患者腫瘤最大徑、腫瘤體積大于非甲基化患者，分化程度越低、臨床分期越高甲基化幾率越高，提示BMP3、BCAT1甲基化情況越明顯，腫瘤最大徑越大、腫瘤體積越大、分化程度越低、臨床分期越高，可能促使腫瘤進一步惡化，疾病越嚴重。

綜上所述，結腸癌中BMP3、BCAT1甲基化程度升高，對結腸癌有較高的診斷價值，且與臨床病理資料關系密切，在臨床上有一定應用價值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

李紅海：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；張曉鈿：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；房一鳴：課題設計，實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；吳俊梅：進行統計學分析