益智醒腦方對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力及炎癥因子的影響

朱 寧，馬曉珊，陳春麗，陳 怡，朱德康

(南方醫科大學南海醫院，廣東 佛山 528244)

阿爾茨海默病是一種神經退行性病變，屬于老年癡呆中常見的疾病類型之一[1-2]。在臨床上以認知功能下降、記憶力減退、社交存在障礙、精神行為異常等為主要臨床癥狀，其中最為常見的臨床癥狀為認知功能障礙。目前，關于阿爾茨海默病的病理學研究主要集中在β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)能夠通過多途徑促使腦組織的氧化應激狀態被激活，產生大量活性氧，抑制多種抗氧化酶，產生多種氧化應激產物，誘導基因調控紊亂、線粒體產能障礙、能量代謝異常及形態學改變等多種后續惡性級聯反應，從而導致細胞凋亡，誘發機體衰老和認知障礙等疾病[3-4]。近年來，中醫藥在預防、治療阿爾茨海默病方面取得了豐富的理論及臨床經驗[5-6]。基于此，本研究將探討益智醒腦方對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力及對白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12月齡清潔級老年Wistar大鼠，雄性，共90只，體重(450±20)g，購自于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK(京)2012-0001。購買后寄養于我校實驗室，分籠飼養，相對濕度控制在50%～70%，溫度(22±2)℃，在實驗期間自由飲食、攝水。

1.2 儀器及試劑 購自安徽淮北正華生物儀器設備公司生產的ZH0065型Morris水迷宮操作系統；北京六一儀器廠生產的DYY-7C型電泳儀；深圳瑞沃德生物儀器設備有限公司生產的數字型單臂腦立體定位儀；Sartorius公司生產的BT125D型萬分之一電子天平；德國Leica公司生產的切片、包埋機、脫水機；Nikon公司生產的CI-L型生物顯微鏡。武漢博士德生物工程有限公司生產的HRP標記兔抗羊二抗(BA1060)、HRP標記羊抗兔二抗(BA1051)、HRP標記羊抗小鼠二康(BA1051)、42KD(BM0627)，小鼠單抗β-actin；天津市漢中攝影材料廠生產的顯影定影試劑盒；柯達生產的XBT-1型X線膠片；Thermo生產的NCI5079型ECL底物液；Cell signaling生產的10176-2-AP型100-140KD，兔單抗ASPP；abcam生產的Ab190684型270KD,兔免單抗SorLA；abcam生產的Ab10099型85KD，羊多抗VPS35；Milli-pore生產的IPVH00010型0.45 μm PVDF膜；fermentas生產的26619-1型10-250KD蛋白marker；北京全式金生物技術有限公司生產的DM111型14-120KD蛋白maeker；Amresco生產的Amresc00761型TEMED；上海酶聯生物科技有限公司生產的IL-1β、IL-6、TNF-α試劑盒。

1.3 實驗藥物 益智醒腦方組方，黨參18 g，遠志、枸杞子、生山楂、炒酸棗仁、茯苓各15 g。上述中藥材均由我院中藥房提供。上述藥材用4500 g水浸泡45 min，先用武火煮沸，文火煎煮30 min，將藥液倒出，備用；取1500 g水進行二次煎煮，煮20 min后，將兩次藥液混合，濃縮。得到含生藥量2 g/ml的溶液。鹽酸多奈哌齊片(國藥準字H20030583)研末，將其制成0.045 mg/ml濃度的水溶液，保存于4 ℃冰箱內備用。

1.4 實驗方法

1.4.1 建立模型：90只大鼠飼養7 d后，隨機分為六組，分別為高劑量益智醒腦方組(高劑量組)、中劑量益智醒腦方組(中劑量組)、低劑量益智醒腦方組(低劑量組)、正常組、模型組及西藥組，每組15只。其中正常組不做處理，其余各組均行Aβ1-42造模，操作方法：將大鼠麻醉后，備皮，固定，于大鼠頭頂中矢狀線做長約1.5 cm切口，暴露顱骨及前囟，尋找“人”“十”字縫。根據腦立體定位圖譜，以“十”字縫交叉點為零坐標，選擇前囟后4 mm，左右旁開3 mm標記，針尖對準并鉆孔。取2 μl Aβ1-42，將針直刺入4 mm后，注射及留針各5 min，退針、縫合、消毒、青霉素肌注、保暖待蘇醒。

1.4.2 給藥：造模3 d后，模型組及假手術組分別灌注等體積生理鹽水，高劑量組、中劑量組、低劑量組各組按人與動物表面積折算法按照6.8、3.4、1.7 mg/(kg·d)灌胃，西藥組0.45 mg/(kg·d)灌胃，連續4周。

1.5 標本制備及指標檢測

1.5.1 取材方法：采用Morris水迷宮實驗后，禁食12 h，對體重進行測量，6%水合氯醛麻醉后斷頭，將腦快速置于冰盤，將海馬分離，稱重，勻漿，置入2.5 ml EP管，標記，存放于-80 ℃冰箱內，備用。

1.5.2 Morris水迷宮實驗：上述給藥結束后，大鼠空間學習記憶能力采用Morris水迷宮實驗檢測。該實驗分為兩部分包括空間探查和定位航行。將凈水注入池內，高出平臺2 cm，大鼠分別從東、西、南、北四個方向面向池壁置于水中，觀察90 s，對90 s內大鼠找到平臺的時間進行記錄，若大鼠未找到平臺，將其引導至平臺，停留10 s，待其熟悉周圍環境后，將其身體上的水擦干，保暖。對大鼠進行連續6 d的訓練，第7 天進行空間探查實驗，將平臺撤去，再次根據上述方法將大鼠從東、西、南、北任意位置置于水中，對大鼠第1次穿過原平臺的時間、90 s內跨越原平臺次數等進行記錄。

1.5.3 淀粉樣前體蛋白(Amyloid precusor protein，APP)、囊泡分揀蛋白35 (Vacuolar protein sorting-35,VPS35)、SorLA的表達檢測：取1/2海馬組織，蛋白濃度采用BCA法測定。將分離膠和濃縮膠配置，上樣，經10%SDS-PAGE電泳。采取濕法轉移電泳產物。PVDF膜取封閉液浸泡，搖床封閉2 h。采用TBST稀釋并孵育一抗，4 ℃，孵育12 h。37 ℃搖床孵育二抗2 h。洗去二抗。將過氧化物酶溶液與增強液混勻，將其滴在PVDF膜上，反應，覆膜，采用X線膠片壓片后顯影，掃描膠片，膠片灰度值采用BandScan分析。

1.5.4 海馬炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平檢測：勻漿后另1/2海馬組織采用酶聯免疫吸附法測定IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠學習記憶力比較 見表1。高劑量組及正常組穿越平臺次數均高于模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中西藥組穿越平臺次數高于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組穿越平臺次數均高于模型組及低劑量組，模型組穿越平臺次數均高于低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)；高劑量組逃避潛伏期均低于模型組、正常組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中西藥組逃避潛伏期均低于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組逃避潛伏期均低于模型組及低劑量組，模型組逃避潛伏期低于低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)。高劑量組穿越平臺次數及逃避潛伏期與正常組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠學習記憶力比較

2.2 各組大鼠APP、VPS35、SorLA的表達比較 見表2。正常組APP、VPS35、SorLA的表達高于高劑量組、模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中高劑量組APP、VPS35、SorLA的表達均高于模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，西藥組APP、VPS35、SorLA的表達均高于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組APP、VPS35、SorLA的表達高于模型組及低劑量組，低劑量組APP、VPS35、SorLA的表達均高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠APP、VPS35、SorLA的表達比較

2.3 各組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 見表3。正常組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均低于高劑量組、模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，西藥組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組及低劑量組，低劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較(pg/ml)

3 討 論

阿爾茨海默病在中醫學中屬于“善忘”“呆病”“癡呆”等范疇[7]，該病病機為髓海不足，神機失司，其主要病位在腦，腦的主要生理特征為靈機記性皆在腦、精明之府、清竅之府、髓之海，諸邪蒙蔽清竅或腦失所養會導致腦部發生病變，誘發阿爾茨海默病。腦與脾腎關系密切，脾胃為氣血生化之源，脾胃虛弱則氣血生化乏源，精血不足則不能滋養腦髓，腦竅失養誘發該病；腎藏精，生髓，充于腦，腎精不足則無力滋養腦髓，其中腎精不足分為腎陰不足及腎陽不足，腎陰不足則虛火灼傷津液形成痰，痰瘀結于腦絡，阻塞腦絡，造成腦及肢體功能失調，誘發癡呆。故治則為健脾益氣、補腎填精。益智醒腦方中黨參具有補中益氣、生津養血之功效；枸杞子具有滋補肝腎，益精明目之功效；生山楂具有消食健胃、活血化瘀之功效；炒酸棗仁具有寧心安神之功效；遠志具有安神益智之功效；茯苓具有滲濕利水、健脾和胃、寧心安神之功效。諸藥合用共達滋補肝腎、健脾和胃、安神益智、寧心安神之功效。據相關研究證實[8]，腦室內注入Aβ能夠模擬大鼠的學習記憶障礙，導致腦內Aβ異常沉積及Tau蛋白的過度磷酸化及損傷中樞膽堿能系統。故通過Aβ寡聚體建立阿爾茨海默病大鼠模型，是研究Aβ神經毒性和阿爾茨海默病通過藥物治療的最佳模型[9]。以往已有研究證實[10-11]，中藥方劑能夠抑制海馬神經元凋亡，改善阿爾茨海默病大鼠的學習記憶能力。本研究結果顯示，高劑量組及正常組穿越平臺次數高于模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中西藥組穿越平臺次數高于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組穿越平臺次數高于模型組及低劑量組，模型組穿越平臺次數高于低劑量組；高劑量組逃避潛伏期低于模型組、正常組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中西藥組逃避潛伏期低于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組逃避潛伏期低于模型組及低劑量組，模型組逃避潛伏期低于低劑量組。高劑量組穿越平臺次數及逃避潛伏期與正常組比較，差異無統計學意義。以往研究結果顯示，提示益智醒腦方能夠改善阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力，且改善效果與藥物劑量密切相關。

SorLA屬于VPS10p受體蛋白家族中的一員，其能夠轉運細胞膜和細胞器之間的物質[12]。SorLA主要特點為擁有獨立的功能模塊，該模塊決定了SorLA能夠分選蛋白質，其常存在于大腦皮層的椎體細胞、海馬及小腦的浦肯野細胞，廣泛分布于周圍和中樞神經系統的神經元。VPS35是逆運復合物中貨物識別亞單元中的關鍵組成部分，與阿爾茨海默病的相關神經退行性病理生理改變密切相關[13]。APP是一種110～130 kDa的Ⅰ型跨膜蛋白，正常生理情況下，其具有營養和保護神經的作用。但APP進入淀粉樣途徑再經β內切酶剪切后，會產生神經毒性作用的Aβ。故抑制進入淀粉樣蛋白途徑的APP，能夠降低Aβ[14-15]。已有研究證實[16]，SorLA能夠直接與APP合作并與VPS35組成的Retromer共同參與APP的產生及運輸，其受體與APP相結合后，能夠抑制β-水解酶把APP解成Aβ的可能性。本研究結果顯示，正常組APP、VPS35、SorLA的表達高于高劑量組、模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中高劑量組APP、VPS35、SorLA的表達高于模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，西藥組APP、VPS35、SorLA的表達高于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組APP、VPS35、SorLA的表達高于模型組及低劑量組，低劑量組APP、VPS35、SorLA的表達高于模型組，提示益智醒腦方能夠促使阿爾茨海默病大鼠APP、VPS35、SorLA的表達恢復正常。這可能是由于益智醒腦方能夠促使更多的APP通過VPS35構成復合體轉運到高爾基體內，行二次囊泡運轉，經α分泌酶降解后，降低經β分泌酶途徑的APP，抑制Aβ的生成；另外，能夠增多進入溶酶體途徑的Aβ，促使Aβ清除。但具體機制需進一步研究證實。

近年研究證實[17]，在阿爾茨海默病的病理過程中炎癥因子介導的炎癥反應發揮了重要作用。其不僅會誘發非特異性炎性細胞浸潤，且能夠引發機體內的慢性炎癥，且在炎癥過程中會誘導大量Aβ沉積，損傷腦部及神經系統，故抑制炎癥反應在治療阿爾茨海默病中具有重要意義。IL-1β、IL-6、TNF-α是老年斑附近的小膠質細胞核星形膠質細胞釋放的最主要的炎癥細胞因子[18-19]。已有研究證實[20]，Aβ沉積會誘發正常腦組織產生炎癥反應，從而釋放炎癥因子包括IL-1β、IL-6、TNF-α，導致腦內炎癥微環境。本研究結果顯示，正常組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于高劑量組、模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，其中高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組、西藥組、中劑量組及低劑量組，西藥組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組、中劑量組及低劑量組，中劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組及低劑量組，低劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于模型組，提示益智醒腦方能夠降低阿爾茨海默病大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平。其具體原因如下：經現代藥理學證實，黨參具有改善胃潰瘍、增強胃腸動力、抗炎、抗氧化、調節糖脂代謝、免疫調節及抗腫瘤等作用；遠志寡糖酯類成分具有抗癡呆、抗抑郁、神經元保護等中樞藥理活性，其作用機制與生物信號的激活進而發揮相應的神經保護作用或者抑制凋亡密切相關；枸杞子具有降血糖、抗脂肪肝、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、延緩衰老、抗應激及增強免疫等作用；生山楂具有降血脂、保肝、降壓、助消化、強心、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等作用；炒酸棗仁具有鎮靜催眠、抗焦慮、抗抑郁、抗炎和抗驚厥等廣泛的藥理作用；茯苓具有免疫調節、利尿、保肝、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用。

綜上所述，益智醒腦方能夠改善阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力，調節APP、VPS35、SorLA的表達，降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平。