加州鱸致病性鐮刀菌的分離鑒定及其藥物敏感性分析

于交平，羅 蒙，馮國清，梁志凌，劉振興，郝 樂，馬艷平，馬江耀，柯 浩

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所水產(chǎn)病害研究室，廣州 510000；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站，廣州 510000；4.廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實驗室，廣州 510000)

加州鱸學(xué)名大口黑鱸(Micropterussalmoides)，是我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種之一[1]。2019年養(yǎng)殖總量477 808 t，廣東省產(chǎn)量超過270 000 t，居全國第一[2]。但是由于養(yǎng)殖面積不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度逐年增加,苗種、飼料質(zhì)量參差不齊和濫用藥物，加州鱸的各種病害問題日益凸顯，其中細(xì)菌性、病毒性、寄生蟲病害相關(guān)報道較多[3-6]，而真菌性疾病研究較少[7]。

鐮刀菌(Fusarium)作為一種植物致病菌被人們所熟知，可引起多種植物的枯萎、腐爛等[8]，某些菌種也會誘發(fā)人類皮膚、角膜炎癥和惡性腫瘤[9]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌對水產(chǎn)動物的危害日趨嚴(yán)重。1960年H?rter[10]首次從瀕死鯉魚(Cyprinuscarpio)分離到黃色鐮刀菌(F.culmorum)，病魚體表有大量的白色覆蓋物。此后，陸續(xù)有真鯛(Pagrusmajor)[11]、加州鱸[7]、鯽(Carassiusauratus)[12]等感染鐮刀菌的報道。目前治療鐮刀菌病的化學(xué)藥物孔雀石綠被禁用，K制劑、龍膽紫等毒性較大，因此通過篩選出有抑菌效果的藥物，可為今后水產(chǎn)臨床藥物申報提供參考依據(jù)[13]。2019年7月，廣州某養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的加州鱸頭部、胸鰭、尾部出現(xiàn)充血發(fā)炎，隨后逐漸潰爛，并附有白色絲狀物，最終不斷死亡。本實驗組從瀕死加州鱸患病部位分離得到一株優(yōu)勢菌。對其進(jìn)行了鑒定、藥物敏感性檢測和生理特性研究，旨在為加州鱸病害的臨床診斷和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康加州鱸購自廣州某公司，體長(119.23±11.93)mm，體質(zhì)量(20.77±5.09)g，體表無損傷，置于室外水產(chǎn)實驗場暫養(yǎng)7 d，水溫(28±2)℃，每天按體重1%投喂飼料。觀察并確認(rèn)無發(fā)病和死亡現(xiàn)象后移入室內(nèi)水族箱(50 cm×40 cm×28 cm)，水溫(25±0.5)℃，24 h不間斷曝氣。

1.1.2 藥敏試驗質(zhì)控菌株

近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)(ATCC 22019)由美國菌種保藏中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 致病菌的分離純化

取瀕死魚患病部位，75%酒精浸洗2～3 s后無菌水沖洗3～4次，接種于PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)。將出現(xiàn)的菌絲轉(zhuǎn)置新的PDA平板，直到培養(yǎng)物純凈為止。

1.2.2 致病菌的觀察

切取小塊培養(yǎng)物，分別放在PDA、CMC、SDA平板上，觀察不同培養(yǎng)基菌落特征。取適量菌絲，鏡檢，觀察菌絲、孢子等形態(tài)學(xué)特征。

1.2.3 致病菌的鑒定

使用Fungal DNA Kit提取真菌DNA。采用真菌通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG、ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序：預(yù)變性94 ℃ 3 min；變性94 ℃ 30 s，退火55℃ 45s，延伸72 ℃ 1 min,35個循環(huán)；終延伸72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，交由北京擎科生物科技有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對，選取同源性較高的序列，用MEGA 7.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 致病菌的人工感染實驗

孢子液制備參照文獻(xiàn)[14]。

取60尾加州鱸隨機(jī)平均放入4個水族箱。腹腔注射實驗組每尾魚按0.2 mL注射濃度為1×107個/mL孢子液，對照組注射等量無菌生理鹽水，以體表充血發(fā)炎判斷為感染。創(chuàng)傷感染實驗組將每尾魚體表劃傷，置于含1×107個/mL孢子的水中，對照組劃傷置于自來水中，以體表有菌絲附著判斷為感染。每天觀察、記錄感染和死亡情況，計算感染率和死亡率。

感染率=(感染魚數(shù)/實驗魚總數(shù))×100%，

死亡率=(死亡魚數(shù)/實驗魚總數(shù))×100%。

1.2.5 不同濃度的孢子液人工感染實驗

孢子液制備同1.2.4，梯度稀釋至1×102(T1組)、1×103(T2組)、1×104(T3組)、1×105(T4組)、1×106(T5組)、1×107個/mL(T6組)。

取健康的加州鱸105尾隨機(jī)平均放入7個水族箱。6個濃度組按0.2 mL腹腔注射孢子液，對照組(C組)注射等量生理鹽水。每天觀察和記錄死亡情況。利用Probit法計算半數(shù)致死量(LD50)[15]。

1.2.6 致病菌藥敏試驗

采用瓊脂稀釋法和微量液體稀釋法，測定最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)[16]。質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌。

1.2.6.1 抗真菌藥物液制備

酮康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、克霉唑、伊曲康唑、制霉菌素、益康唑和咪康唑購自某生物試劑公司，純度均在98%以上。除氟康唑和5-氟胞嘧啶溶于無菌蒸餾水，其余藥物均溶于DMSO。藥物的測試濃度范圍：兩性霉素B、克霉唑、伊曲康唑、益康唑、咪康唑為0.0313～16 μg/mL，酮康唑、制霉菌素、氟康唑、5-氟胞嘧啶為0.125～64 μg/mL。

1.2.6.2 孢子液制備

制備方法同1.2.4，用RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋至1～5×105個/mL，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 致病菌生理特性實驗

按照Hussein等[17]的方法用無菌打孔器制備6 mm的菌餅，放于PDA平板中央，分別于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃培養(yǎng)，每組3個重復(fù)；用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)PDA的pH為4.32、5.73、6.86、7.85、8.91、9.72、10.58、11.44，將菌餅分別放于上述平板中央，25 ℃培養(yǎng)，每組3個重復(fù)；將菌餅分別放于含NaCl濃度為0%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10%的PDA平板中央，25 ℃培養(yǎng)，每組3個重復(fù)。均在4 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

2 結(jié)果

2.1 致病菌的形態(tài)觀察

從加州鱸患病部位分離純化得到一株真菌，命名MY1。在PDA上培養(yǎng)4～5d鋪滿平板，菌落正面白色，有發(fā)達(dá)的白色棉絮狀氣生菌絲(圖1A)；在CMA上生長特征與PDA相似(圖1B)；在SDA上，產(chǎn)黃色色素，菌落背面及培養(yǎng)基由黃色變?yōu)辄S褐色，其他特征與PDA相似(圖1C、1D)。

圖1 MY1菌落形態(tài)

在顯微鏡下觀察到菌絲體彎曲，具分枝，部分有分隔(圖2A)；小分生孢子卵圓形或橢圓形，0～1個分隔，大小約為13.6～31.8 μm×2.8～3.9μm(圖2A箭頭指出)；大分生孢子鐮刀型，兩端較鈍，頂端稍彎，多數(shù)為3個分隔，大小約為62.3～113.7 μm×3.5～6.2 μm(圖2B)。

圖2 MY1菌絲及分生孢子

2.2 致病菌rDNA-ITS序列分析

采用真菌通用引物ITS1、ITS4，以純化MY1的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在500～750bp之間有明顯的擴(kuò)增條帶(圖3)。菌株MY1的ITS序列長度為548 bp，在GenBank上的登錄號為：MN625846。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，與Fusariumsolani的相似性高達(dá)99%以上。通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果進(jìn)一步表明，MY1與腐皮鐮刀菌(F.solani)(KT876546.1)的同源關(guān)系最近(圖4)。結(jié)合形態(tài)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果，斷定MY1為腐皮鐮刀菌(F.solani)。

圖3 rDNA-ITS通用引物對菌株MY1進(jìn)行PCR結(jié)果

圖4 基于rDNA-ITS序列的菌株MY1的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 致病菌的人工感染實驗

腹腔注射實驗組魚腹部和肛周充血發(fā)炎(圖5A)；尾鰭發(fā)黑，有缺失現(xiàn)象(圖5B)；體表有脫鱗現(xiàn)象。進(jìn)一步解剖發(fā)現(xiàn)，肝臟、腸出血，脾臟發(fā)黑腫大(圖5C)。在第3 d出現(xiàn)感染和死亡，第6 d感染率100%，第9 d死亡率為100%。創(chuàng)傷實驗組感染魚體表有菌絲附著(圖5D)，第3 d出現(xiàn)感染，第4 d開始死亡，第7 d感染率100%，第11 d死亡率為100%。而兩組對照組均一切正常。從瀕死加州鱸上分離純化得到的菌株，其形態(tài)特征和rDNA-ITS序列與MY1一致。可以判定腐皮鐮刀菌為加州鱸的一種致病菌。

圖5 實驗組加州鱸發(fā)病癥狀

2.4 不同濃度孢子液人工感染實驗

統(tǒng)計14 d實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹腔注射不同濃度的孢子液，死亡率明顯不同(表1)。除對照組外，各濃度組均有死亡現(xiàn)象。死亡率隨孢子液濃度升高而增加，其中T1和T2組死亡率較低，且均低于20%；剩余濃度組死亡率均超過50%，T5和T6組死亡率100%。根據(jù)Probit法計算，MY1對加州鱸的LD50為1.03×104個/mL。

表1 腹腔注射不同濃度組死亡統(tǒng)計結(jié)果

2.5 藥敏實驗結(jié)果

2.5.1 藥物初篩

采用微量液體稀釋法以藥物最高測試濃度進(jìn)行實驗。MY1在含有兩性霉素B(16 μg/mL)、克霉唑(16 μg/mL)、益康唑(16 μg/mL)和制霉菌素(64 μg/mL)的孔中生長被抑制；在氟康唑(64 μg/mL)、酮康唑(64 μg/mL)、咪康唑(16 μg/mL)、伊曲康唑(16 μg/mL)和5-氟胞嘧啶(64 μg/mL)的孔中正常生長。因此選兩性霉素B、克霉唑、益康唑和制霉菌素進(jìn)行后續(xù)藥敏實驗。

2.5.2 藥物敏感實驗結(jié)果

本實驗質(zhì)控菌株MIC值均在參考范圍之內(nèi)。

采用微量液體稀釋法和瓊脂稀釋法測定4種藥物對腐皮鐮刀菌的MIC值(表2)。克霉唑、益康唑和制霉菌素兩種方法結(jié)果一致，MIC分別為16 μg/mL、8 μg/mL和32 μg/mL；兩性霉素B微量液體稀釋法MIC為8 μg/mL，瓊脂稀釋法MIC為16 μg/mL。

表2 藥敏結(jié)果

2.6 生理特性

2.6.1 溫度對MY1菌生長的影響

如表3，菌MY1在10 ～35 ℃范圍內(nèi)均可生長；在5 ℃和40 ℃時，不生長；25 ～30 ℃生長最快；10 ℃時生長最慢。因此，菌MY1最適生長溫度為25～30 ℃。

表3 溫度對菌MY1生長的影響

2.6.2 pH值對菌MY1生長的影響

如表4，菌MY1在pH4.32～11.44時均可生長；隨著pH值增加，菌絲生長速度先上升后下降，在pH7.85時生長最快。因此，菌MY1生長最適pH為7.85。

表4 pH值對菌MY1生長的影響

2.6.3 鹽度對菌MY1生長的影響

如表5，MY1在0%～8%范圍內(nèi)可生長，但隨著培養(yǎng)基中NaCl含量增加，生長速度顯著下降(P<0.05)，當(dāng)NaCl10%時，停止生長。

3 討論

3.1 腐皮鐮刀菌的致病性

鐮刀菌種類繁多，至今已報道超過500種，是植物常見致病菌，也可感染人類及動物，具有致病范圍廣和致病力強(qiáng)等特點(diǎn)[18]。腐皮鐮刀菌可引起凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)黑鰓病[19]、綠海龜(Cheloniamydas)背甲壞死病[20]、海馬(Hippocampuserectus)皮膚壞死和潰爛[21]，也會感染斑馬魚(Daniorerio)[22]和黑斑條尾魟(Taeniuramelanopsila)[23]，致死率較高。尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)導(dǎo)致斑馬魚[24]、羅非魚(Oreochromisniloticus)[25]、真鯛[11]等死亡。本研究中，發(fā)病加州鱸的癥狀，與已報道的加州鱸[7]、真鯛[11]等魚類感染鐮刀菌的癥狀相似，從患病部位分離純化到一株優(yōu)勢菌MY1，通過形態(tài)學(xué)特征和rDNA-ITS序列同源比對及聚類分析，確定為腐皮鐮刀菌。人工感染實驗結(jié)果表明，該菌對加州鱸有較強(qiáng)的致病力。鐮刀菌孢子濃度的增加，死亡率隨之增加，說明當(dāng)孢子達(dá)到一定數(shù)量時，鐮刀菌病便會爆發(fā)。此外，黃文芳等[13]和可小麗等[14]研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌侵染魚體與體表損傷或不良的養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)。因此，減少水產(chǎn)動物的機(jī)械損傷，凈化養(yǎng)殖水體，或采用防治藥物，降低水中的孢子濃度，抑制鐮刀菌的生長，能減少鐮刀菌病的發(fā)生。

3.2 腐皮鐮刀菌耐藥性

本研究選取了幾種常見的抗真菌藥物對腐皮鐮刀菌進(jìn)行體外藥效試驗，結(jié)果顯示，該菌對兩性霉素B、克霉唑、益康唑、制霉菌素4種藥物敏感。與林嘉銘等[19]、龐溦等[20]研究結(jié)果不完全一致，究其原因可能與菌株不同環(huán)境、不同生理特性等因素有關(guān)。另外，除兩性霉素B瓊脂稀釋法MIC值比微量液體稀釋法高，其余藥物兩種方法結(jié)果一致，可能是由于兩性霉素B對溫度敏感，導(dǎo)致藥效部分失效。張世奇[16]篩選抗水霉藥物也發(fā)現(xiàn)瓊脂稀釋法MIC值較高。

3.3 腐皮鐮刀菌生理特性

通過生理特性研究發(fā)現(xiàn)，本實驗分離到的腐皮鐮刀菌，對溫度、pH有較廣的耐受范圍，且最適生長溫度與加州鱸最適溫度一致，表明在魚任何生長時段，都有感染該菌的可能性。黃文芳等[7]、張艷珍等[12]研究也發(fā)現(xiàn)鐮刀菌病原菌的適應(yīng)性較強(qiáng)，能夠很好地適應(yīng)水環(huán)境。氯化鈉在生產(chǎn)上用于魚類真菌病的防治，本研究發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)基中氯化鈉含量的增加，腐皮鐮刀菌菌絲生長速度顯著下降，甚至生長被完全抑制。

4 結(jié)論

本研究從加州鱸患病部位分離純化得到一株強(qiáng)致病性腐皮鐮刀菌，在10～35 ℃和pH 4.32～11.44時均可生長，氯化鈉、兩性霉素B、克霉唑、益康唑、制霉菌素對其有抑菌效果。