飼料鋅對長江鱘幼魚腸道微生物組成的影響

吳金平，楊代勤，杜 浩，羅 江，熊 偉，劉 源，朱建強，危起偉

(1.長江大學農學院，湖北荊州，434025；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，農業農村部淡水生物多樣性保護重點實驗室，武漢， 430223)

鋅是動物機體代謝中的一種重要營養素，幾乎存在于所有的生物組織中[1]。鋅也是魚類必需的微量元素之一，其作為體內100多種酶的組成成分或激活因子，參與核酸和蛋白質的合成、能量代謝、氧化還原等生化代謝過程；還可以通過調節激素、酶和生長因子的活性及參與骨細胞核酸和蛋白質的代謝進而影響魚體的骨骼發育[2]。養殖魚類缺鋅會表征出生長抑制、厭食、高死亡率、降低蛋白質與碳水化合物的消化率、降低機體抵抗力與DNA損傷及氧化應激一系列癥狀[3-8]。近些年，許多養殖魚類對飼料鋅的需要量已有研究，且不同的養殖魚類對飼料鋅的需要量也不一致，如部分草食性魚類飼料鋅需要量為32.6～190.39 mg/kg[2，9-10]、部分雜食性性魚類飼料鋅需要量為32.37～79.51 mg/kg[3，5，11]及部分肉食性魚類飼料鋅需要量為15.0～84.6 mg/kg[4，12-15]。關于養殖魚類對飼料鋅的需要量主要以增重率、鋅的蓄積量或其它生化指標作為評判依據。脊椎動物腸道微生物群落是一個復雜的微生態系統，其數目龐大，種類繁雜，包含了各種各樣的細菌、真菌、古生菌及病毒[16]。已有研究表明納米氧化鋅離子投喂鯉(Cyprinuscarpio)6周后，處理組的Chao1平均數、Observed OTUs 平均數較對照組升高[17],而飼料鋅對魚類腸道微生物組成的影響還鮮見報道。

動物腸道菌群具有影響和調節宿主腸道的多種功能，包括合成維生素，調節新陳代謝，營養吸收，免疫系統發育及防止病原體定植等[18]。有學者提出調控養殖魚類腸道菌群是改善養殖魚類的飼料效率、生長與健康的重要途徑之一[19]。Ring?等[20]報道一些魚類攝取益生元后，可以促進其生長與存活，有益于豐富腸道細菌，提高免疫反應和降低對病原菌的敏感性。基于此，本研究采用16S rRNA高通量測序方法檢測分析了三種不同鋅處理水平的飼料投喂長江鱘(Acipenserdabryanus)幼魚8周后，其腸道菌群多樣性及菌落結構組成，以期從營養與微生物學的角度探索飼料鋅是否對魚類腸道菌群多樣性及菌落結構組成具有調控作用，從而為飼料鋅的合理添加提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 飼料制作

本實驗采用酪蛋白-明膠、糊精與魚油、豆油作為實驗飼料的蛋白源、糖源與脂肪源，其配方與營養成分組成見表1。以ZnSO4·7H2O為鋅源，各組鋅添加濃度分別為0、40 和320 mg/kg 飼料，經檢測各組實測值分別為14.77 mg/kg(A組)，57.71 mg/kg(B組) 和364.5 mg/kg(C組)飼料，檢測方法參照GB/T(13885-2017)，鋅的檢出限為5 mg/kg。飼料制作前，所有的干物質原料經粉碎機粉碎后，過60目分級篩，按照飼料配方表分別稱取不同的原料，混勻。最后加20%左右的純凈水，待充分混勻后，用絞肉機加工制作成直徑4 mm的長條圓形顆粒；飼料在室內陰涼風干后置于-20 ℃冰箱保存備用。

表1 飼料配方組成與營養成分

1.2 實驗魚養殖與樣品采集

實驗所用的長江鱘幼魚來源于長江水產研究所太湖試驗場當年繁殖的子二代。實驗開始前用基礎飼料投喂實驗魚2周。正式實驗開始前，隨機挑選初始體質量為(52.88 ± 0.98)g，規格一致、體質健壯的幼魚135尾分養于9個直徑105 cm，體積0.43 m3的養殖桶中，每個處理組3個重復，每重復15尾魚，飼養8周。采取表觀飽食法投喂，每日投喂3次。飼養期間的水溫為18.1～20.8 ℃，溶氧大于5 mg/L，pH為7.90～8.05，氨氮質量濃度小于0.5 mg/L，養殖用水為經過曝氣與過濾后的地下井水。每天測量水溫與溶氧，每天排污1次，每次排掉養殖桶中水體積的1/3。

養殖實驗結束后，每個處理隨機取5尾魚，測量體重、體長與全長(見表2)，麻醉，解剖后取出后腸，剝離后腸的糞，液氮速凍后立即置于-80 ℃冰箱保存。

表2 實驗魚的體重與體長(N=5，平均值±標準差)

1.3 樣本DNA提取，PCR擴增與高通量測序

將保存好的樣品送往武漢邁維代謝生物科技公司進行樣品DNA提取、建庫和16S rRNA擴增子高通量測序。流程為：利用16S V3-V4變異區引物(515F-806R)對提取樣品的DNA進行擴增；對目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產物；使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000進行上機測序。

1.4 數據分析

從下機數據中拆分出各樣本數據，經截去Barcode和引物序列后使用FLASH[21]對每個樣本的reads進行拼接，得到的拼接序列為原始Tags；拼接得到的Raw Tags經過濾處理[22]得到高質量的Tags數據，參照Qiime[23]的Tags質量控制流程操作。經過處理后得到的Tags需要進行去除嵌合體序列的處理，Tags序列通過(https://github.com/torognes/vsearch/)[24]與物種注釋數據庫進行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數據(Effective Tags)。利用Uparse軟件[25]對所有樣本的全部 Effective Tags進行聚類，默認以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)，同時選取OTUs的代表性序列。對OTUs序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA132[26]的SSUrRNA數據庫[27]進行物種注釋分析。使用Qiime軟件計算Observed-otus，Chao1，Shannon，Simpson，ace，Goods-coverage，PD_whole_tree 指數。本實驗中所有數據采用IBM 22.0統計軟件中的單因素方差分析(one-wany ANOVA)和Duncan’s均值多重比較法進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著，結果以平均值±標準差表示

2 結果

2.1 飼料鋅對長江鱘幼魚腸道α-多樣性的影響

從表3可知，飼料鋅對長江鱘幼魚腸道α-多樣性產生了影響，且所有樣品的Good＿coverage(覆蓋率)均在0.995 4以上，表明本次實驗中各處理組的樣品微生物種類均已檢測到。隨著飼料鋅水平的升高，ACE指數、Chao1指數與Observed species指數出現了下降的趨勢，三種指數均在飼料鋅364.5 mg/kg時最低，364.5 mg/kg組與14.77 mg/kg組之間差異顯著，與57.71 mg/kg組之間無顯著差異。香濃指數、辛普森指數與PD-whole tree值也表現出隨飼料鋅水平的升高而出現下降的趨勢，且三種指數均在364.5 mg/kg時最低，但各組之間無顯著性差異。

表3 飼料鋅對長江鱘幼魚腸道α-多樣性的影響

2.2 飼料鋅對長江鱘幼魚腸道菌群群落結構組成的影響

從圖1可以發現，在科水平下， A、B、C處理組梭桿菌科分別占到了37.55%、32.44%、42.63%，表明飼料中鋅含量達到364.5mg/kg時，長江鱘幼魚后腸的梭桿菌科的相對豐度最高。腸桿菌科分別占到了11.24%、41.56%、36.93%，表明飼料中鋅含量達到57.71 mg/kg時，長江鱘幼魚后腸的腸桿菌科的相對豐度最高。隨飼料鋅水平的升高，梭菌科類的百分比出現了下降的趨勢，發現14.77 mg/kg組的百分比值最高為32.03%，而B、C處理組中分別占到了18.90%、13.80%。上述3個科在A、B、C 3個處理組中分別占80.82%、92.89%、93.37%，表明在不同鋅飼料處理水平下，上述3個科在魚類腸道菌群的組成中占據了優勢。同樣發現，希萬氏菌科在A、B、C 3個處理組中分別占2.04%，0.21%，0.62%，且隨著飼料鋅水平的增加而出現降低的趨勢。而相對豐度不在前10的科中，其他的科在A、B、C 3個組分別占9.15%，3.86%，5.21%。綜上可知，飼料中鋅含量不同對細菌科的組成有影響。

圖1 科水平下不同處理組長江鱘幼魚腸道菌群組成的相對豐度

從圖2可以發現，在屬水平下，A、B、C處理組鯨桿菌屬分別占到了31.28%、27.57%，35.71%；梭菌屬類分別占到了36.87%，18.55%，14.05%；鄰單胞菌屬分別占到了8.76%，33.60%，18.92%；檸檬酸桿菌屬分別占到了1.42%，1.84%，20.60%；上述4種細菌屬總和百分比分別達78.32%，81.56%，89.28%，表明這4種細菌屬是優勢屬。在前10種細菌屬之外的屬中，A、B、C 3個處理組，分別占到了14.28%，14.44%，8.96%，上述結果表明飼料中鋅含量的不同也會對細菌屬的比例組成產生顯著影響。

圖2 屬水平下不同處理組長江鱘幼魚腸道菌群組成的相對豐度

2.3 飼料鋅對長江鱘幼魚腸道OTU數量的影響

從圖3可知，不同鋅處理下的飼料對長江鱘幼魚腸道OTU數量產生了顯著影響。A、B、C處理組中總OTU數量隨飼料鋅含量的上升出現降低的趨勢。其中，A、B、C 3個處理組中總OTU數分別為1 160，790，654。A與B組共有的OUT數為622；B與C組共有的OUT數為400；A與C組共有的OUT數為510；A、B、C 3個處理組共有的OUT數為371。

圖3 不同鋅飼料處理下的OTU分布

3 討論

魚體腸道微生物對魚的大小、代謝、攝食行為及免疫反應都有影響[28]；同時腸道菌群對腸道形態、營養吸收及代謝機制有著重要影響，有益菌與有害菌的動態平衡及正常分布與否是保證宿主能否健康生長的重要基礎[29]。因此，維持魚體健康的腸道菌群，對于養殖魚類的健康生長有著重要的意義。Alpha多樣性用于分析樣本內(Within-community)的微生物群落多樣性[30]，通過單樣本的Alpha 多樣性分析可以反映樣本內的微生物群落的豐富度和多樣性。本實驗結果表明不同鋅含量的飼料對長江鱘幼魚腸道菌群的ACE、Chao1與Observed species 指數均產生了顯著影響，3種指數均表現出隨飼料鋅含量的增加而出現下降的趨勢，且低劑量與高劑量鋅處理組差異顯著，這表明腸道菌群的豐富度受到飼料鋅含量的影響，特別是飼料高劑量鋅組的腸道菌群豐富度明顯下降，表明飼料鋅含量過高不利于魚類腸道健康，與Chuapani等[17]報道納米氧化鋅離子投喂鯉6周后處理組的Chao1平均數、Observed OTUs 平均數較對照組升高的研究結果不一致，上述實驗結果不一致可能與處理物質的類型及濃度、實驗對象的種類與規格、實驗持續時間、養殖環境與營養條件等是否一致而密切有關。鱘魚營養研究發現，不同的鱘類攝食相同的飼料，其腸道菌群的豐富度與多樣性也是不一致的[31]，表明了每種特定的魚類可能有著獨有的腸道微生物組成結構。本次實驗中，Shannon、Simpson與PD-whole tree等指數的趨勢均是降低的，但與對照組相比差異不明顯，表明本次實驗中飼料鋅含量還不足以對上述3種腸道菌群的多樣性指數產生顯著性影響。

測序結果顯示，在科水平上排名前10的梭桿菌科、腸桿菌科與梭菌科3個科的總和百分比在不同鋅含量的飼料組分別達到了80.82%、92.89%、93.37%，表明不同鋅處理水平下腸道核心的菌落種群結構并未發生大的變化。阮瑞等[32]對人工養殖達氏鰉(Husodauricus)幼魚腸道菌群組成進行了分析，發現梭菌科占科分類中的98.137%，同時也發現了少量的梭桿菌科與腸桿菌科。Geraylou等[19]在關于西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)投喂阿拉伯木聚糖寡糖實驗中也發現了梭桿菌科與梭菌科，并且發現魚攝食含阿拉伯木聚糖寡糖的飼料后梭桿菌科的豐度是降低的，而梭菌科的豐度是上升的，這些結果表明梭桿菌科、腸桿菌科與梭菌科是鱘魚腸道菌落中比較重要的科之一，其百分占比可能因飼料營養與養殖環境不同而表現出異同性。進一步在屬水平上分析發現，鯨桿菌屬、梭菌屬類、鄰單胞菌屬與檸檬酸桿菌屬等4種細菌屬總和百分比分別達78.32%，81.56%，89.28%，表明這4種細菌屬可能是優勢屬。Han等[33]報道的鯨桿菌屬是肉食性魚類主要的屬之一，本實驗結果與之相符；同時有研究表明，屬的水平上草食性魚類腸道中主要以具有降解纖維素功能的梭菌屬、檸檬酸桿菌屬和纖毛菌屬(Leptotrichia)為主[33]，本研究中梭菌屬與檸檬酸桿菌屬也是長江鱘幼魚腸道菌優勢屬之一，這主要與鱘魚是一種雜食偏肉食的食性而密切有關。在前10種細菌屬之外的屬中，3個處理組分別占到了14.28%，14.44%，8.96%，表明了飼料中鋅達到一定水平時(364.5 mg/kg)會影響腸道菌群的組成結構。另外通過venn圖發現不同鋅處理下的飼料對長江鱘幼魚腸道OTU數量產生了影響，隨飼料鋅含量的增加，長江鱘幼魚腸道OTU數量從1 160下降到654；而三種飼料鋅處理下三個組共有的OTU數為371個，占三者總和的25.71%，這表明在相同養殖環境下，長江鱘幼魚后腸腸道菌群的相似性受飼料鋅處理的影響比較大；這與水曉梅等[34]報道的大豆濃縮蛋白對大黃魚生長和腸道微生物菌落的影響中大豆濃縮蛋白替代魚粉為0%、25%與100%時三者共有的OTU數為64個，占三者總數的68.08%的結果不一致。