隔山消提取物對功能性消化不良模型大鼠腦腸肽及胃腸道功能的作用機(jī)制研究*

秦 蘭 ，游景瑞 ，潘 潔 ，孫 佳 ，劉春花 ，彭 梅 ，林昌虎 △

（1. 貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心·省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004； 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004； 3. 貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004）

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：Allegra X30 型離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Model 680 型酶標(biāo)儀（美國 Bio －Rad 公司）；IMS－20 型全自動雪花制冰機(jī)（常熟市雪科電器有限公司）；UV－2401PC 型紫外可見分光光度計（日本島津儀器公司）；AE240 型電子天平（梅特勒－托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為十萬分之一）；Nikon Eclipse Cl 型正置光學(xué)顯微鏡，Nikon DS－U3 型成像系統(tǒng)，均購自日本尼康公司。

試藥：隔山消藥材產(chǎn)地為貴州凱里，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室劉春花副教授鑒定為蘿科植物耳葉牛皮消 Cynanchum auriculatum Royle ex Wight 的干燥塊根；鹽酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為20180628）；多潘立酮（西安楊森制藥有限公司，批號為90301693）；蘇木精－伊紅染液（HE，武漢市皮諾飛生物科技有限公司，批號為 P10011）；血漿 MTL 試劑盒，GAS 試劑盒，VIP 試劑盒，腫瘤壞死因子 －α（TNF －α）試劑盒，批號均為20191220，均購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

動物：健康SPF級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量220～240g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK （湘）2014 －0011。均適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周，飼養(yǎng)于溫度為（22±2）℃、相對濕度為45% ～60%的動物房內(nèi)。試驗(yàn)方案均通過貴州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

藥物制備：取干燥隔山消塊根，粉碎成粗粉，用70% 乙醇回流提取 3 次，第 1 次 8 倍量（m ／ V）70% 乙醇回流提取 1.5 h，第 2 次、第 3 次 6 倍量（m ／ V）70%乙醇回流提取1.0 h，過濾，合并濾液，減壓，濃縮得稠膏，將稠膏加水溶解成每1 mL 含1 g 生藥的溶液，加熱溶解，靜置過夜，取上清液濃縮，過D－101 大孔吸附樹脂柱，依次用3 倍柱體積水、60%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗脫液，減壓，濃縮得稠膏［9］。

分組、建模及給藥：將48 只SPF 級雄性SD 大鼠隨機(jī)分為正常組（A 組），模型組（B 組，0.5 mol／L 冰鹽酸），多潘立酮組（C 組），隔山消提取物低、中、高劑量組（D1組、D2組、D3組），各 8 只。除 A 組外，其余大鼠均不規(guī)則喂養(yǎng)（隔1 d 不定時提供食物），同時按8 mL／kg 的容量灌胃 0.5 mol／L 冰鹽酸 21 d，1 d 1 次，以誘發(fā)脾胃虛寒型FD 大鼠模型，A 組大鼠僅灌胃等量生理鹽水。造模第 11 天后，D1組、D2組、D3組大鼠分別灌胃 0.5，1.0，2.0 g／kg 隔山消提取物，C 組大鼠灌胃 31.5 mg／kg多潘立酮，A 組和B 組大鼠均灌胃10 mL／kg 生理鹽水，所有大鼠均給藥10 d，1 d 1 次；造模第21 天后，禁食不禁飲24 h，口服灌胃2 mL 10%阿拉伯樹膠＋5%活性炭，30 min 后股動脈取血，解剖，取出胃及小腸。

小腸推進(jìn)率測定：將小腸置含有少量生理鹽水的培養(yǎng)皿上，用鑷子分離腸系膜，鋪展于少量生理鹽水潤濕的玻璃板上，用直尺測量小腸總長度（ L，幽門前端至回盲部）及從幽門前端到碳墨最前端的距離（ S，即碳墨推進(jìn)距離），按公式計算小腸推進(jìn)率。

小腸推進(jìn)率（%）＝ L ／ S × 100%［10］

大鼠胃竇部組織病理變化觀察：采用HE 染色法，取大鼠胃竇部（距幽門上端0.5 cm）組織，用4%多聚甲醛固定，逐級脫水，包埋，切片，染色，封片，在200 倍顯微鏡下觀察胃竇組織的病理變化。

血漿 MTL，GAS，VIP，TNF －α 水平測定：造模成功后，股動脈取血，置肝素化的離心管中，離心（3 000 r／min）30 min，取上層澄清液體，儲存于－20 ℃ 冰箱中待用，臨用前取出，采用酶聯(lián)免疫吸附法，按試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀于450 nm 波長處檢測，讀取各樣品的吸光度值（A），測定血漿中 MTL，GAS，VIP，TNF － α 水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小腸推進(jìn)率

與A 組比較，B 組大鼠的小腸推進(jìn)率顯著降低（P ＜ 0.05）；與 B 組比較，C 組、D1組、D2組、D3組大鼠的小腸推進(jìn)率均顯著升高（P ＜0.05）。結(jié)果見表 1。

表1 隔山消提取物對各組大鼠小腸推進(jìn)率的影響（，%，n ＝8）Tab.1 Effect of the extract of Cynanchum auriculatum Radix on the small intestine propulsion rate of rats in each group（，%，n ＝8）

表1 隔山消提取物對各組大鼠小腸推進(jìn)率的影響（，%，n ＝8）Tab.1 Effect of the extract of Cynanchum auriculatum Radix on the small intestine propulsion rate of rats in each group（，%，n ＝8）

注：與 A 組比較，*P ＜ 0.05；與 B 組比較，＃P ＜ 0.05。Note：Compared with those in group A，*P ＜ 0.05；compared with those in group B，＃P ＜ 0.05.

組別A 組B 組C 組D1 組D2 組D3 組小腸全長（cm）104.83 ± 13.14 113.00 ± 10.35 110.83 ± 7.99 99.33 ± 10.54 112.50 ± 2.07 110.33 ± 7.58推進(jìn)長度（cm）92.33 ± 5.61 72.00 ± 14.90 81.83 ± 7.36 76.67 ± 7.69 77.83 ± 12.89 73.67 ± 9.33推進(jìn)率（%）79.92 ± 2.82 63.85 ± 12.22*73.80 ± 3.49＃77.30 ± 3.45＃79.16 ± 7.08＃79.34 ± 9.23＃

2.2 血漿中 MTL，GAS，VIP，TNF －α 水平

與A 組比較，B 組大鼠血漿MTL 和GAS 水平均顯著降低，VIP 和 TNF －α 水平均顯著升高（P ＜0.001）；與B 組比較，C 組、D3組大鼠血漿 MTL 水平均顯著升高（P ＜ 0.01），C 組、D1組、D2組、D3組大鼠 GAS 水平均顯著升高，TNF － α 水平均顯著降低（P ＜ 0.05 或P ＜ 0.01），C 組、D2組、D3組大鼠 VIP 水平均顯著降低（P ＜ 0.01）；且 D3組與 C 組藥效相當(dāng)。結(jié)果見表 2。

表2 隔山消提取物對各組大鼠胃腸激素及炎性因子的影響（，pg ／mL，n ＝8）Tab.2 Effect of the extract of Cynanchum auriculatum Radix on gastrointestinal hormones and inflammatory factors of rats in each group（，pg ／mL，n ＝ 8）

表2 隔山消提取物對各組大鼠胃腸激素及炎性因子的影響（，pg ／mL，n ＝8）Tab.2 Effect of the extract of Cynanchum auriculatum Radix on gastrointestinal hormones and inflammatory factors of rats in each group（，pg ／mL，n ＝ 8）

注：與 A 組比較，**P ＜0.01；與 B 組比較，＃P ＜0.05， ＃＃P ＜0.01。Note: Compared with those in group A， ** P ＜ 0.01；compared with those in group B，＃P ＜ 0.05， ＃＃P ＜ 0.01.

組別A 組B 組C 組D1 組D2 組D3 組MTL 392.00 ± 24.16 278.40 ± 31.48**368.85 ± 31.25＃＃289.40 ± 37.63 305.90 ± 39.91 345.00 ± 33.92＃＃GAS 281.95 ±20.46 119.34 ±29.69**226.86 ± 24.34＃＃176.78 ±33.52＃206.89 ±39.35＃＃233.24 ±42.21＃＃VIP 148.88 ±22.15 228.21 ±15.57**153.66 ± 15.41＃＃210.37 ±16.03 193.34 ±18.90＃＃171.32 ±13.04＃＃TNF－α 46.85 ±16.96 191.88 ±22.91**75.34 ± 30.18＃＃138.01 ±19.44＃＃106.64 ±12.19＃＃79.16 ±14.34＃＃

2.3 大鼠胃竇部組織病理變化

A 組大鼠胃竇部組織未見明顯變化；B 組大鼠整體輕度異常，部分黏膜層細(xì)胞空泡變性，黏膜上皮細(xì)胞無明顯脫落，黏膜層未見明顯炎性細(xì)胞浸潤及壞死，基本排除器質(zhì)性損傷，符合FD 病變特征，說明建模成功。其余各組大鼠胃組織結(jié)構(gòu)整體正常，黏膜上皮細(xì)胞無明顯脫落，黏膜層未見明顯炎性細(xì)胞浸潤及壞死。詳見圖1。

圖1 大鼠胃竇部組織病理切片圖（HE 染色，×200）Fig.1 The pathological section of the tissue of gastric antrum of the rats（HE staining，× 200）

3 討論

FD 模型有動力障礙型，如嗎啡、抗腫瘤藥物抑制胃腸蠕動；另一種常見模型為內(nèi)臟高敏型，常采用碘乙酰胺造模法、胃酸刺激法、夾鼠尾法及復(fù)合因素造模法（不規(guī)則喂養(yǎng)、夾尾刺激、光刺激等）［11］。研究表明，F(xiàn)D 的發(fā)病與內(nèi)臟敏感性增高有關(guān)［12］。本研究中前期試驗(yàn)時，采用了致內(nèi)臟高敏的造模方式，如夾鼠尾刺激法和復(fù)合因素造模法，結(jié)果在單純采用外部刺激的方式下，大鼠個體差異及對環(huán)境刺激改變的耐受性差異較大，導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性差。故本研究中采用口服灌胃冰稀鹽酸加不規(guī)律喂養(yǎng)法造模，鹽酸可以進(jìn)入胃黏膜下層，刺激胃腸平滑肌收縮，延緩胃內(nèi)壓恢復(fù)，減慢胃排空，刺激胃液分泌，致胃寒脹滿［13］。李杲《蘭室秘藏·中滿腹脹門》提出：“多食寒涼之人，胃中寒則脹滿，或臟寒生滿病。”不規(guī)則喂養(yǎng)可致飲食失律，日久則脾胃虛弱，氣機(jī)不暢，符合中醫(yī)學(xué)中脾胃虛弱證型。通過觀察大鼠造模成功后的狀態(tài)，模型大鼠出現(xiàn)倦臥少動、扎堆、拱背、反應(yīng)遲鈍，捉拿時反抗無力，飲水、飲食量逐漸減少，體質(zhì)量呈下降趨勢，皮毛粗糙、稀疏，便溏等現(xiàn)象。有研究表明，該方法導(dǎo)致的內(nèi)臟敏感性增加受神經(jīng)及腦腸肽共同調(diào)控，一方面通過酸刺激迷走神經(jīng)通路，產(chǎn)生抑制性胃腸反射；另一方面氫離子可激活十二指腸傳入通道的酸感受器受體釋放一氧化氮［14］。一氧化氮是非腎上腺能神經(jīng)和非膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)，介導(dǎo)胃容受性舒張的反射活動，并具有抗乙酰膽堿對胃的收縮作用，影響胃的舒張、蠕動和排空。可見，該造模方法更貼合現(xiàn)代人群FD 的發(fā)病機(jī)制，且操作簡單，造模重復(fù)性好，存活率較高。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)D 患者普遍存在腦腸肽分泌異常和胃腸道黏膜炎癥，胃腸動力障礙疾病與胃腸道的免疫細(xì)胞浸潤有關(guān)，免疫細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)可能介導(dǎo)了胃腸動力的改變［15］。TNF－α 是一種誘導(dǎo)細(xì)胞化學(xué)趨勢表達(dá)的機(jī)體炎性因子，主要與腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞分泌，在腫瘤炎性微環(huán)境中發(fā)揮啟動慢性炎癥的作用，對于促進(jìn)炎性細(xì)胞在病變部位聚集和釋放中起重要作用，而FD 患者血清中炎性因子水平顯著高于正常人群［16］。MTL 是一個由22 個氨基酸所組成的多肽，可使胃體、胃竇收縮，幽門松弛，在消化間期對胃排空起促進(jìn)作用。GAS 屬胃分泌的一種胃腸激素，有刺激胃壁細(xì)胞分泌胃蛋白酶原、促進(jìn)胰液和膽汁分泌的作用。如果GAS 分泌不足，會引起消化功能方面的問題，導(dǎo)致胃腸道功能紊亂，引起慢性胃炎、消化不良。VIP 是一種神經(jīng)肽，主要來自腸道神經(jīng)元，可抑制下食管括約肌、胃、膽囊、小腸環(huán)形肌和血管平滑肌收縮，其分泌增加會抑制胃腸道運(yùn)動。研究表明，胃腸道功能障礙小鼠體內(nèi)胃腸激素MTL 和GAS 的水平會降低，而 VIP 水平會升高［9］。

綜上所述，隔山消提取物改善FD 的作用機(jī)制除可能與升高 MTL 和 GAS 水平，降低 VIP 和 TNF － α 水平有關(guān)外，還可能影響了十二指腸的化學(xué)敏感性傳入通路，減弱了因酸刺激對周圍或脊髓水平的致敏而引起胃的牽張敏感性增強(qiáng)。