不同產地茺蔚子飲片超高效液相色譜指紋圖譜研究*

吳世蓉，張 波△，吳文平，李國衛

（1. 安徽省中醫院，安徽 合肥 230031； 2. 廣東一方制藥有限公司·廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 廣州 528244）

茺蔚子為唇形科植物益母草 Leonurus japonicus Houtt. 的干燥成熟果實，性微寒，味苦、辛，有活血調經、清肝明目之功效，臨床多用于治療月經不調、經來腹痛、目赤翳障等證［1］。其化學成分主要包括生物堿、黃酮類、二萜類、強心苷等［2－3］。已有文獻報道茺蔚子的質量控制方法，但多集中于茺蔚子中鹽酸水蘇堿的含量測定，對藥材的指紋圖譜研究較少［4－5］。茺蔚子在全國各地均有分布和種植［6］，市售品產地眾多，質量不一，采用單一成分的含量測定方法來評價，不能全面反映其整體質量。本研究中采用超高效液相色譜（UPLC）法對不同產地茺蔚子飲片進行指紋圖譜研究，旨在為更加科學地制訂茺蔚子飲片的質量控制標準提供有效依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters H－Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；HWS28 型恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；ME204E 型電子分析天平（精度為 0.1 mg），XP26 型電子分析天平（精度為 0.001 mg），均購自梅特勒－托利多國際貿易（上海）有限公司。

1.2 試藥

4－羥基苯甲酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為101149－201903，含量為 100.0%）；甲醇、乙腈、三氟乙酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水；18 批茺蔚子飲片（市售品），經安徽省中醫院李立華主任中藥師鑒定為正品，產地及編號見表1。

表1 18 批茺蔚子飲片的產地信息Tab.1 Producing habitats of 18 batches of Leonuri Fructus

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：WatersHSST3柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈（A）－0.1% 三氟乙酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～ 3 min 時 0 A，3 ～ 15 min 時 0 A→4%A，15 ～ 22 min時 4%A→6%A，22 ～ 25 min 時 6%A→9%A，25 ～28 min 時 9%A →10%A，28 ～ 40 min 時 10%A，40 ～40.1 min 時 10%A→80%A，40.1 ～45 min 時 80%A）；流速：0.30 mL ／min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液制備

稱取4－羥基苯甲酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為20 μg／mL 的對照品溶液。取藥材飲片樣品粉末（過50 目篩）約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇100 mL，稱定質量，加熱回流30 min，靜置，冷卻至室溫，再次稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

精密度試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定6 次，以4－羥基苯甲酸峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各共有峰相對保留時間和相對峰面積的 RSD 均小于3% （ n ＝ 7），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置 0，2，4，6，8，12，24 h 時按 2.1 項下色譜條件進樣測定，以4－羥基苯甲酸峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各共有峰相對保留時間和相對峰面積的 RSD 均小于3%（ n ＝7），表明供試品溶液在室溫放置24 h 內基本穩定。

重復性試驗：取藥材飲片樣品（編號為S1）適量，各6 份，按 2.2 項下方法制備供試品溶液，再按 2.1 項下色譜條件進樣測定。以4－羥基苯甲酸峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各共有峰相對保留時間和相對峰面積的 RSD 均小于3%（ n ＝ 6），表明方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜研究

指紋圖譜建立：取茺蔚子飲片18 批，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，18批茺蔚子飲片的指紋圖譜見圖1。將色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.0 版）”軟件，與對照圖譜進行自動匹配，即得對照指紋圖譜，詳見圖2。標定共有峰13 個，各批樣品的共有峰峰面積見表2。通過與對照品比對，鑒定出1 個主成分，詳見圖3。

表2 18 批茺蔚子飲片超高效液相色譜圖共有峰的相對峰面積Tab.2 Relative peak areas of common peaks in 18 batches of Leonuri Fructus by UPLC

圖1 18 批茺蔚子飲片超高效液相色譜圖疊加指紋圖譜Fig.1 UPLC superimposed fingerprints of 18 batches of Leonuri Fructus

圖2 茺蔚子飲片超高效液相色譜圖對照指紋圖譜Fig.2 UPLC reference fingerprint of Leonuri Fructus

圖3 對照品溶液高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of the reference solution

相似度計算：將18 批茺蔚子飲片的指紋圖譜均導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.0 版）”軟件，計算相似度。結果18 批飲片與對照指紋圖譜的相似度范圍為 0.801 ～0.982，僅玉林市的 3 批與對照指紋圖譜相似度小于0.88（表3），表明各產地飲片質量較接近。

表3 18 批茺蔚子飲片指紋圖譜相似度評價結果Tab.3 Similarity evaluation of fingerprints of 18 batches of Leonuri Fructus

聚類分析：采用SPSS 20.0 統計學軟件分別對18批茺蔚子飲片進行聚類，采用組間平均數聯結法，以夾角余弦作為相似度的判定公式。結果，18 批飲片樣品聚為 3 類，Ⅰ類包括 S7，S8，S16，S17，S18（信陽市 2 批、臨沂市 3 批）；Ⅱ類包括 S1，S2，S3，S4，S5，S6，S12，S13，S14，S15（綏化市 4 批、信陽市 3 批、南陽市 3 批）；Ⅲ類包括 S9，S10，S11（均來自玉林市）。詳見圖 4。

圖4 18 批茺蔚子飲片聚類分析結果Fig.4 Results of cluster analysis of 18 batches of Leonuri Fructus

共有峰主成分分析：采用SPSS 20.0 統計學軟件分別對18 批茺蔚子飲片指紋圖譜所得的13 個共有峰進行主成分分析，得出相關矩陣的特征值及其方差，詳見表 4。可見，前 3 個成分的特征值分別為 6.446，2.124，1.437，對總方差的累計貢獻率達76.981%，基本保留了原樣本的信息，故確定提取的主成分有3 個。主成分1 主要影響因素為色譜峰 4，10，12，主成分 2 為色譜峰2，3，主成分 3 為色譜峰 6，7，故用前 3 個主成分即可表示原UPLC 數據的主要信息，詳見表5。權重值的前3 名變量分別為 0.942，0.933，0.887，對應色譜峰 12，4，10，即為判斷不同產地茺蔚子飲片質量的重要因素。

表4 特征根、各主成分的貢獻率Tab.4 Contribution rate of characteristic root and each principal components

表5 各因子初始因子載荷矩陣Tab.5 Initial factor load matrix of each factor

不同產地茺蔚子飲片綜合評價：針對前3 個主成分對茺蔚子飲片進行綜合評價，按方差貢獻率加權計算綜合得分，結果見表6。排名前5 的樣品中包括臨沂市的3批和信陽市的2 批；排名前5 ～10 的樣品中包括綏化市的3 批和信陽市的2 批。總體來說，臨沂市的茺蔚子飲片質量較優且穩定；玉林市的整體質量較差，綜合排名靠后；南陽市的質量一般且穩定；信陽市的質量不是很均勻，有優有劣。由三維得分散點圖可知，18 批飲片可分為 3 類，其中，Ⅰ類包括 S7，S8，S16，S17，S18（信陽市2 批、臨沂市 3 批）；Ⅱ類包括 S1，S2，S3，S12，S13，S14，S15（綏化市 4 批、南陽市 3 批 ）；Ⅲ類包括 S4，S5，S6，S9，S10，S11（玉林市、信陽市各 3 批）。詳見圖 5。

表6 主成分得分、綜合得分及排序Tab.6 Principal components scores，comprehensive scores and their ranking

圖5 主成分三維得分散點圖Fig.5 3D scatter plot of principal components

3 討論

3.1 供試品制備方法及液相色譜條件優化

預試驗中對不同提取溶劑（無水甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇）的提取效果進行了比較，結果70%甲醇提取的色譜峰信息更豐富，峰面積響應值較高且基線相對平穩。對不同提取方式（超聲提取、加熱回流提取）、不同提取時間（15，30，60 min）的考察結果表明，加熱回流提取30 min 的提取效果較好。前期研究中發現，茺蔚子的化學成分較豐富，考慮采用HPLC 法的分析時間可能較長，故采用UPLC 法分析，通過對條件進行優化，最終在45 min 內完成對圖譜的分析，并確定13 個共有峰，在保證全面反映茺蔚子飲片全貌的前提下，提高了分析效率。

3.2 特征圖譜測定結果

目前，茺蔚子的研究主要針對茺蔚子的生物堿、氨基酸、脂肪酸等成分進行分析［5，7－11］。本研究中通過建立茺蔚子飲片UPLC 指紋圖譜，對茺蔚子飲片的成分進行了較全面地分析，18 批茺蔚子飲片與對照指紋圖譜的相似度范圍為 0.801 ～0.982，15 批飲片與對照指紋圖譜的相似度在0.88 以上，為不同產地茺蔚子飲片的質量評價提供了參考。2020 年版《中國藥典（一部）》茺蔚子項下規定的含量測定指標為鹽酸水蘇堿，預試驗中未找到與鹽酸水蘇堿對照品保留時間一致的色譜峰，通過與現有文獻比對，推測可能原因是鹽酸水蘇堿為末端吸收，檢測波長多以192 nm 為主，本研究中為能反映茺蔚子飲片的整體成分，選擇了色譜峰信息較豐富的254 nm作為檢測波長。另外，鹽酸水蘇堿在茺蔚子中的含量較低，藥典檢測方法中需經中性氧化鋁柱純化富集，本研究為全面反映茺蔚子飲片質量的全貌，故采用超聲提取。本研究中通過對照方式確定了1 個成分，即4－羥基苯甲酸，最終確定為參照峰，提高了方法的專屬性和耐用性。

3.3 聚類分析及主成分分析結果

以往對中藥材樣品僅進行含量測定或指紋圖譜等常規化學試驗分析，易忽略中藥材質量與其性狀、產地、采收、加工等因素的關聯，近年來，通過化學計量學方式能進一步挖掘中藥材的質量與性狀、產地、采收、加工等因素間的聯系，為中藥材的質量研究提供了新的分析手段。本研究中在建立茺蔚子飲片UPLC 指紋圖譜的基礎上，通過聚類分析、主成分分析進一步挖掘樣品質量與產地間的關聯。結果表明，茺蔚子飲片不同產地間存在顯著差異，建立的化學識別模式可對不同產地的茺蔚子飲片進行科學評價，不同產地茺蔚子飲片大致可分為3 類，其中臨沂市所產的茺蔚子飲片在2 種評價方法中均能穩定地分為1 類，且主成分綜合評分排名靠前，說明該產地飲片樣品質優且穩定；而玉林市的3 批樣品排名靠后，原因可能與茺蔚子飲片產地的南北分布有關。該結論與多項研究結果［4，12－16］基本一致，說明所建立的方法具有一定的科學性和合理性，可用于茺蔚子飲片的質量評價。

3.4 方法評價

本研究中共收集了全國5 個不同產地共18 批茺蔚子飲片，樣品具有一定的代表性，基本可反映茺蔚子飲片的整體性與差異性。中藥飲片質量易受生長環境、土壤性質、氣候等因素影響，因此，通過運用聚類分析、主成分分析等評價手段，建立全面、客觀、科學的茺蔚子質量評價方法，可為茺蔚子飲片的真偽鑒別和質量控制提供參考。