梔黃消瘀止痛膏中梔子苷含量測定*

2021-07-15 01:27:28魯明明林新艷鄔學群許金海范趙翔殷書梅

中國藥業 2021年13期

魯明明，林新艷，鄔學群，莫文，許金海，范趙翔，龔麗，殷書梅 △

（1. 江蘇康緣陽光藥業有限公司，江蘇南京 210046； 2. 上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032）

梔黃消瘀止痛膏由梔子、大黃、木瓜等多味中藥組方，配以飴糖攪拌賦型而成，具有活血化瘀、消腫止痛功效，臨床用于治療踝、膝、肘、腕等關節的跌打損傷、急性

軟組織損傷，療效較好［1－2］。原劑型采用傳統工藝制成，難以滿足清潔性及低過敏性等要求，不便于攜帶保存，使應用受到限制，工藝改良后制成了橡膠膏。梔子味苦、性寒，為方中君藥，功效見于《神農本草》、后續本草及歷版《中國藥典》［3－4］，能瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒，且對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌及皮膚致病癬菌均有廣譜抗菌作用［5］。其有效成分是以梔子苷（別名京尼平苷）為代表的環烯醚萜苷類及有機酸酯類成分［3］，具有解熱、鎮痛、利膽、抗炎、緩瀉、治療軟組織損傷等作用［6－12］。本研究中建立了測定新型梔黃消瘀止痛膏中梔子苷含量的方法，以確保產品質量、臨床應用的安全性及有效性。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（配有四元泵、可變波長掃描紫外檢測器，日本安捷倫科技有限公司）；Mettler AG135 型電子天平、Mettler AB135S 型電子天平（梅特勒－托利多＜上海＞有限公司，精度均為十萬分之一）；HH－2 型恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；KQ－500DE 型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

梔子苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110749 －201919，純度為 97.1%）；梔黃消瘀止痛膏（江蘇康緣陽光藥業有限公司，批號分別為200501，200502，200503）；甲醇（批號為 200106022H），乙醇（分析純，批號為200211160H），均購自南京化學試劑股份有限公司；乙腈（色譜純，美國天地有限公司，批號為19025118）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性試驗［13 －14］

色譜柱：島津 WondasilC18－WR 柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈－水（10∶90，V／ V）；流速：1.0mL／min；檢測波長：238 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。理論板數按梔子苷峰計不低于1 500。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。由于梔子苷為樣品梔子中的獨有成分，故未進行陰性對照試驗。

圖1 高效液相色譜圖1.geniposideA.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制備［15］

取樣品貼膏2 片，除去蓋襯，將藥膏刮下，混合均勻，取1 g，精密稱定，加入50 mL 甲醇，稱定質量，超聲提取50 min，冷卻后稱定質量，用甲醇補足減失的質量，將溶液搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取梔子苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含30 μg的溶液，即得對照品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察：取梔子苷對照品適量，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成每1 mL 含15.1 mg 的對照品貯備液；精密吸取對照品貯備液適量，以甲醇稀釋，配制成質量濃度為7.55，15.10，30.20，75.50，151.00 μg ／mL 的系列對照品溶液。按2.1 項下色譜條件各進樣10 μL，重復2 次，測定峰面積，以對照品溶液進樣質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得梔子苷的回歸方程 Y ＝ 15.708 X － 26.668（ R2＝ 0.999 4，n ＝10）。結果梔子苷的質量濃度在 7.55 ～151.00 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取同一梔子苷對照品溶液（質量濃度為 30.20 μg ／mL）6 份，按 2.1 項下色譜條件進樣10 μL，測定峰面積。結果峰面積的平均值為451.10，RSD 為 1.52%（n ＝ 6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品1 g，精密稱定，平行6 份，依法制備供試品溶液，并進樣測定含量。結果梔子苷含量的平均值為 1.59 mg ／g，RSD 為 0.92% （n ＝ 6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取重復性試驗項下供試品溶液適量，分別于 0，2，4，8，12，24 h 時進樣 10 μL 測定。結果梔子苷峰面積的平均值為 494.98，RSD 為 1.53% （n ＝ 6），表明供試品溶液在24 h 內穩定。

加樣回收試驗：取樣品（梔子苷含量為1.59 mg／g）1 g，精密稱定，平行9 份，每3 份為1 組，分別按含梔子苷 0.5，1.0，1.5 mg ／g 準確加入梔子苷對照品溶液，制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 梔子苷加樣回收試驗結果（n ＝9）Tab.1 Results of the recovery test of geniposide（n ＝9）

2.4 樣品含量測定

取 3 批（批號分別為 200501，200502，200503）樣品各1 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，進樣測定，并計算梔子苷的含量。結果3 批樣品中梔子苷的含量分別為1.61，1.61，1.62 mg ／g。中藥材質量受產地、季節、采收期等諸多因素影響，故梔子藥材的梔子苷含量存在偏差，結合以上3 批樣品含量測定結果，擬暫定梔黃消瘀止痛膏所含梔子苷的含量不低于1.45 mg／g。

3 討論

3.1 超聲提取溶劑和提取時間選擇

考察了2 種超聲提取溶劑（甲醇和乙醇）對提取結果的影響。結果，采用甲醇超聲處理的供試品溶液的色譜峰可完全分離，乙醇制備的供試品溶液的色譜圖中，梔子苷色譜峰與其他成分無法有效分離，且峰形較差，故選擇提取溶劑為甲醇。考察了不同超聲提取時間（30，40，50，60 min）對提取結果的影響。結果，50 min 和 60 min時梔子苷的提取率和提取效率基本一致，且均高于30 min 和40 min，從節約能源、提高工作效率方面考慮，故最終選擇超聲提取時間為50 min。

3.2 色譜條件選擇

考察了不同流速（0.8，0.9，1.0，1.1 mL ／min）對提取結果的影響，結果供試品溶液中梔子苷峰在上述4 種流速下均能較好分離，表明不同流速條件下的耐用性均較好。考察了不同柱溫（30，35，40 ℃）對提取結果的影響，結果供試品溶液中梔子苷色譜峰在上述3 種柱溫下均能較好分離，表明不同溫度條件下的耐用性均較好。考察了不同流動相比例［乙腈－水（15 ∶85，V ／ V）、乙腈－水（12 ∶88，V ／ V）、乙腈－水（10 ∶90，V ／ V）］對提取結果的影響，結果流動相為乙腈－水（10 ∶90，V ／ V）時梔子苷的分離效果和峰形均較好。考察了不同品牌的色譜柱（Kromasil 100－5－C18柱，Epic C185u 柱，Wondasil C18－WR 柱）對提取結果的影響，結果分離度、理論板數均能滿足要求。