纖維微菌C6對水中Cr(Ⅵ)去除條件優化及機理研究

高婧琪， 張 杰， 蹇庭昆， 夏 越， 杜聞崢， 嚴 馨， 馮 甦

(四川大學生命科學學院生物資源與生態環境教育部重點實驗室， 成都 610064)

1 引 言

近幾十年來，人類開展了各種工業生產活動，如鋼鐵生產、冶煉、電鍍、印刷、印染、造紙、紡織、化肥和農藥制造等[1-2]，這些工業活動造成了環境中的重金屬污染.在中國，潛在毒性元素污染了2000萬公頃的耕地，約占耕地總面積的20%，其中鉻(Cr)污染地區占毒性元素污染總面積的5.1%，中國的Cr污染土壤超過總面積的1.1%[3].環境中Cr主要以兩種不同的氧化態存在，六價Cr(Ⅵ)和三價Cr (Ⅲ)[4-5]，其中Cr(Ⅵ)的毒性更大，Cr(Ⅵ)是八種對人體最有害的化學物質之一，也是國際上公認最具致癌性的金屬之一[6-7].長時間的暴露在Cr(Ⅵ)環境中會對人體產生危害，損害皮膚，眼睛，血液，呼吸道和免疫系統[8-9].Cr(Ⅵ)可以顯著減少神經元細胞的數量，表現出神經毒性[10].在細胞水平上，Cr(Ⅵ)的遺傳毒性作用會導致氧化應激、DNA損傷和腫瘤發展的損害[11-12].

從水體中去除Cr(Ⅵ)的傳統方法包括物理化學方法，例如化學沉淀、膜技術、離子交換、電化學處理等[13].這些方法對于高含量Cr(Ⅵ)的去除有一定的效果，但是這些方法效率較低，價格昂貴且有容易造成二次污染的風險[14].為了克服這些問題，生物吸附可以作為一種有效的替代方法，其中微生物吸附技術主要利用微生物的新陳代謝對重金屬進行去除，其經濟性與去除效率較高，且生態友好、具有可持續性，因此被認為是一項很有前景的重金屬修復技術[15-16].

本實驗以成都市雙流區某皮革廠附近受污染的土壤作為分離對象，分離得到的一株高效除Cr(Ⅵ)細菌——纖維微菌C6.用響應面法(response surface methodology，RSM)優化該菌株去除污染廢水中Cr(Ⅵ)的條件.首先通過單因素實驗得到各影響因子的最佳實驗值，探究pH、溫度、反應時間和Cr(Ⅵ)初始濃度四個因素及其交互作用對吸附作用的影響，建立Box-Behnken中心組合設計響應面優化模型對高效除Cr(Ⅵ)細菌的去除條件進行優化，確定最佳吸附條件.同時通過掃描電子顯微鏡(SEM)和傅里葉紅外吸收光譜(FTIR)對吸附Cr(Ⅵ)前后菌體表面結構和官能團的變化進行探究，對菌體去除Cr(Ⅵ)的機理進行初步探討.本研究有助于為Cr(Ⅵ)污染的修復提供新的微生物吸附材料.

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

2.1.1 菌種 成都市雙流區某皮革廠附近污染土壤分離得到的高效除Cr(Ⅵ)細菌，該菌株具有在水體中吸附Cr(Ⅵ)的能力.

2.1.2 試劑 胰蛋白胨，氯化鈉，酵母提取物，甘油，重鉻酸鉀，硫酸，磷酸，丙酮，二苯碳酰二肼，細菌DNA提取試劑盒，細菌16S rRNA基因通用引物F27/R1492(華大基因生物公司)，戊二醛，乙醇.

2.1.3 主要溶液及試劑配制 LB培養基：稱取胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，酵母提取物5 g，加入超純水至1 000 mL，加熱攪拌使之充分溶解，將培養基pH值調至7.3 ± 0.2之間.藍口瓶分裝，于121 ℃下，高壓蒸汽滅菌20 min.LB固體培養基加入15～20 g瓊脂，滅菌冷卻后倒平板.

Cr(Ⅵ)標準溶液：稱取2.829 g在120 ℃干燥2 h至恒重的重鉻酸鉀(K2Cr2O7)，用水溶解后移入1 000 mL容量瓶，用去離子水稀釋至標線并搖勻，配置成每毫升含1 mg的Cr(Ⅵ)標準溶液.

二苯碳酰二肼溶液：稱取0.2 g二苯碳酰二肼溶于50 mL丙酮中，加水稀釋至100 mL搖勻，儲存于棕色瓶中，置于4 ℃冰箱保存備用.

2.1.4 儀器 恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)，UV-2450分光光度計(島津)，PHS-25 pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)，SKY-111B搖床(上海蘇坤有限公司)，AFZ-1002-U艾科浦超純水系統(艾科浦公司)，立式高壓滅菌鍋(上海申安公司).

2.2 方 法

2.2.1 菌株分離 稱取污染土壤樣品10 g，放入裝有90 mL無菌水的150 mL錐形瓶中，取震蕩后的樣品溶液用無菌水依次稀釋，取稀釋的樣品溶液涂布于含有初始Cr(Ⅵ)濃度為50 mg/L的LB固體培養基上，倒置培養.挑取形態不同的單菌落平板劃線，并逐步升高LB固體培養基中Cr(Ⅵ)濃度，反復劃線純化，直至得到多株單一菌落.將純化之后的單一菌落寫好編號，于4 ℃條件下保存備用.

2.2.2 Cr(Ⅵ)標準曲線制作 依次移取Cr(Ⅵ)標準液0.0、 0.25、 0.50、 1.00、 2.00、 3.00、 4.00 mL于25 mL比色管中，用蒸餾水稀釋至12.5 mL標線.向以上溶液分別加入硫酸(1+1)溶液0.5 mL和磷酸(1+1)溶液0.5 mL，加入顯色劑二苯碳酰二肼溶液2 mL，用蒸餾水稀釋至25 mL標線，搖勻，放置10 min左右.在540 nm波長處以空白試劑作為參比測定吸光度.以吸光度為縱坐標，相應Cr(Ⅵ)含量為橫坐標，繪制Cr(Ⅵ)標準曲線.

2.2.3 高效除Cr(Ⅵ)菌株篩選 將篩選出的多株高效耐Cr(Ⅵ)菌株分別無菌接種至LB液體培養基中，振蕩培養16 h作為種子液.向100 mL錐形瓶中加入含Cr(Ⅵ)濃度為50 mg/L的LB液體培養基27 mL，將菌液調節至OD600為1.5，按10%的接種量加入到容量為100 mL錐形瓶中使總體積為30 mL.培養24 h，取培養液離心，再分別取上清液，用二苯碳酰二肼分光光度法測OD540，測定Cr(Ⅵ)含量，并計算Cr(Ⅵ)的去除率，去除率計算見公式：

Cr(Ⅵ)去除率(%)=(C0-Ce)/C0×100%

其中C0為初始Cr(Ⅵ)濃度，Ce為吸附后上清液中Cr(Ⅵ)含量.

比較各培養基中細菌對Cr(Ⅵ)的去除率，篩選出高效除Cr(Ⅵ)菌株.對菌株提取DNA，進行PCR擴增并對擴增產物測序鑒定，測序結果在NCBI網站上的GeneBank數據庫內的進行相似性分析，初步判定菌株的種屬，并在MAGE軟件中構建系統發育樹.

2.2.4 單因素實驗 研究了四個因素對菌體去除Cr(Ⅵ)效率的影響，包括溶液pH(4～11)、溫度(15～40℃)、接觸時間(0.5～5 d)、Cr(Ⅵ)初始濃度(20～120 mg/L).取上述在150 r/min搖床上培養一段時間Cr(Ⅵ)和菌體混合液，在4 ℃，8 000 r/min條件下離心5 min，分別取上清液0.5 mL，用二苯碳酰二肼分光光度法測OD540，并計算Cr(Ⅵ)的含量和去除率，所有實驗設置三組平行實驗.

2.2.5 響應面設計 采用Design-Expert軟件進行響應面優化Box-Behnken實驗設計，分析了溶液pH、溫度、反應時間、Cr(Ⅵ)初始濃度這四個因素相互作用對菌體去除Cr(Ⅵ)效率的影響.響應面變量因素和水平設計分別為溶液pH(6、7、8)，溫度(25、 30、 35 ℃)，反應時間(1、 2、 3 d)，Cr(Ⅵ)初始濃度(40、 60、 80 mg/L).

2.2.6 掃描電子顯微鏡(SEM)分析 使用掃描電子顯微鏡探究纖維微菌C6去除Cr(Ⅵ)前后菌體變化，將吸附前后的菌體用PBS緩沖液沖洗3次，每次20 min，加入3%戊二醛放入4 ℃冰箱固定24 h，8 000 r/min離心5 min，用PBS緩沖液沖洗3次，然后進行乙醇梯度脫水，分別脫水20 min；將處理好的樣品冷凍干燥1 h，噴金上機觀察.

2.2.7 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析 將吸附前后的菌體在8 000 r/min下分別離心5 min，將菌體沉淀在-40 ℃冰箱預凍4 h，再將其轉移至冷凍干燥器中凍干至固體粉末.在樣品中加入KBr，充分混勻研細后壓片，放置于傅里葉紅外吸收光譜儀上，進行紅外光譜的檢測.

3 結果與分析

3.1 菌株篩選及其鑒定

如圖1所示Cr(Ⅵ)標準曲線線性關系為y=0.6282x-0.0012且R2=0.9994，具有較高的相關性，可用于后續實驗Cr(Ⅵ)含量的檢測.將初步篩選得到6株耐Cr(Ⅵ)菌進行研究，發現編號為C6的菌株對Cr(Ⅵ)去除效率最高，達到58.13%.對該菌株進行測序，如圖2所示，經過NCBI數據庫比對和系統發育樹的結果顯示，C6屬于纖維微菌屬，故將其命名為纖維微菌C6，纖維微菌屬是一種放線菌，其特點是具有分解木質纖維素的能力[17]，選取該菌株作為本研究所需菌株開展后續實驗.

圖1 Cr(Ⅵ)含量測定標準曲線Fig.1 Standard curve for Cr(Ⅵ)

3.2 單因素試驗結果與分析

3.2.1 接觸時間對纖維微菌C6去除Cr(Ⅵ)的影響 為了研究不同接觸時間下纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)去除的影響，設置接觸時間分別為0.5、1、1.5、2、3、4、5 d，其他反應條件選取如下：pH=7，溫度 35 ℃，Cr(Ⅵ)初始濃度為20 mg/L.如圖3所示，隨著接觸時間的增加，纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)去除的過程主要分為兩個階段：第一階段在0～2 d內，去除效率增加趨勢明顯，2～5 d去除效率達到平衡狀態，在第2 d達到最大去除效率92.27%，因此采用接觸時間2 d用于后續實驗.

圖2 C6菌株系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of C6 strain

3.2.2 pH對纖維微菌C6去除Cr(Ⅵ)的影響 為了研究不同pH下纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)去除的影響，設置pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11， 其他反應條件選取如下：溫度 35 ℃，Cr(Ⅵ)初始濃度為20 mg/L，接觸時間2 d.如圖4所示，在pH 4～7，隨著pH增大，纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)的去除效率增加；在pH 7～11隨著pH增大 Cr(Ⅵ)的去除效率逐漸減小，在pH為7時達到最適去除條件，去除效率為92.23%，因此采用pH為7用于后續實驗.

3.2.3 溫度對纖維微菌C6去除Cr(Ⅵ)的影響 為了研究不同溫度下纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)去除的影響，設置溫度分別為15、20、25、30、35、40 ℃，其他反應條件選取如下：pH 7，Cr(Ⅵ)初始濃度為20 mg/L，接觸時間2 d.如圖5所示，在15～30 ℃，隨著溫度的增加，Cr(Ⅵ)的去除效率增加，在30 ℃達到最適去除溫度，最高去除效率達到93.89%，在30～40 ℃去除效率基本處于平衡狀態，采用溫度30 ℃用于后續實驗.

圖4 pH對Cr(Ⅵ)去除效率的影響Fig.4 Effect of pH Cr(Ⅵ) removal efficiency

圖5 溫度對Cr(Ⅵ)去除效率的影響

3.2.4 Cr(Ⅵ)初始濃度對纖維微菌C6去除Cr(Ⅵ)的影響 為了研究不同Cr(Ⅵ)初始濃度下纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)去除的影響，設置Cr(Ⅵ)初始濃度分別為20、40、60、80、100、120 mg/L.其他反應條件選取如下：pH 7，接觸時間2 d，溫度30 ℃.如圖6所示，在初始濃度為20～60 mg/L時，隨著Cr(Ⅵ)初始濃度的增加，Cr(Ⅵ)的去除效率增加，在60 mg/L達到最適去除初始濃度，去除效率為94.77%；在60～120 mg/L范圍內，隨著Cr(Ⅵ)初始濃度的增加，Cr(Ⅵ)的去除效率先下降后逐漸達到平衡狀態.

圖6 Cr(Ⅵ)初始濃度對Cr(Ⅵ)去除效率的影響

3.3 響應面試驗結果與分析

本研究在單因素實驗的基礎上，選取4個顯著的影響因素作為對象，利用Design-Expert軟件對纖維微菌C6設計了29組4獨立因素Box-Behnken響應面實驗，如表1所示.運用Design-Expert8.0.5.0軟件，通過對實驗數據進行多元回歸分析，得到二元回歸方程式為:

Y=+74.86-0.48A+4.18B+3.25C-

1.64D+3.49AB+0.70AC-4.02AD+

3.92BC-4.39BD+1.36CD+0.29A2+

3.83B2-5.22C2+3.19D2

表1 纖維微菌C6去除率響應面實驗設計及結果

表2以纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)的去除率作為響應值對響應面結果進行方差分析，由表可知模型P值為0.004 2<0.050 0，回歸顯著，表明擬合的二次多項回歸模型具有統計學意義有良好的預測能力.回歸模型的相關系數R2=0.82表明該模型的擬合程度較好，回歸模型失擬項P值為0.2348>0.05，失擬不顯著，表明模型沒有異常數據，能很好地進行預測.

表2 二元回歸方程的方差分析

殘差分析可以進一步檢驗回歸模型的正確性.若殘差分布圖中的數據點呈現線性趨勢分布，則表示殘差服從正態分布.殘差的正態概率圖如圖7a所示，殘差數據點在直線兩側分布均勻，表明殘差服從正態分布，即回歸模型準確.空間中某一點的所有參數對響應的影響可以根據圖7b所示的攝動圖進行評估.溫度(B)和接觸時間(C)的陡坡表明Cr(Ⅵ)去除率的響應對此因素很敏感.pH(A)接近平坦曲線對Cr(Ⅵ)去除率的敏感性較低.因此溫度和接觸時間是影響Cr(Ⅵ)去除率的關鍵因素.

圖7 纖維微菌C6去除Cr (VI)的殘差正態概率和擾動

根據響應面結果繪制出響應面曲線等高圖如圖8所示，圖8a顯示了溫度和溶液pH對Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用.當溫度在30 ℃以下，溶液pH 5～7時，纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)去除率較高；在32～40 ℃、溶液pH 7～9的范圍內Cr(Ⅵ)去除率隨著溫度和溶液pH的增加而增加.圖8b顯示了接觸時間和溶液pH對Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，如圖8b所示，在溶液pH 5～9時，Cr(Ⅵ)去除率隨著接觸時間的增加而增大.在pH為7，接觸時間為2 d時達到最佳去除效率.圖8c顯示了Cr(Ⅵ)初始濃度和溶液pH對Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，當溶液pH 7～9時，Cr(Ⅵ)初始濃度為40～50 mg/L時或當溶液pH 5～7時，Cr(Ⅵ)初始濃度為65～80 mg/L時，纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)去除率隨著Cr(Ⅵ)初始濃度的增加而增大.圖8d顯示了溫度和接觸時間對Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，如圖8d顯示，在30～40 ℃的范圍內，隨著接觸時間的增加，纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)去除率也在增加.圖8e顯示了溫度和Cr(Ⅵ)初始濃度對Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，在30～40 ℃的范圍內，隨著Cr(Ⅵ)初始濃度的增加，纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)去除率在減少.圖8f顯示了接觸時間和Cr(Ⅵ)初始濃度對Cr(Ⅵ)去除效率的交互作用，在Cr(Ⅵ)初始濃度40～60 mg/L時，隨著接觸時間的增加和Cr(Ⅵ)初始濃度的減小，纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)去除率增加.

在最佳吸附條件下，即pH為7.85，溫度34.07 ℃，接觸時間2.88 d，初始Cr(Ⅵ)濃度40.08 mg/L，纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)的去除率達到最高為95.75%.

3.4 纖維微菌C6去除Cr(Ⅵ)前后SEM分析

如圖9a所示，在沒有Cr(Ⅵ)處理的條件下，纖維微菌C6菌體細胞呈短桿狀，表面清晰光滑且分散.如圖9b所示，Cr(Ⅵ)處理過的菌體表面不規則，有顆粒狀沉淀，并且菌體細胞排列在一起形成粘連的結構.這種由Cr(Ⅵ)脅迫引起的菌株形態變化可能在細菌防御外部Cr(Ⅵ)毒性和Cr(Ⅵ)在細菌細胞表面的吸附機制中起關鍵作用.細菌表面吸附的Cr會引起細菌表面形態的變化.相同的情況也在Karthik等人[18]的研究結果中出現.

3.5 纖維微菌C6去除Cr(Ⅵ)前后FTIR分析

為了研究Cr(Ⅵ)與纖維微菌C6相互作用中可能涉及的官能團，對纖維微菌C6菌體與Cr(Ⅵ)反應前后進行了紅外光譜分析.如圖10所示，在3 274 cm-1觀察到的波段對應于O-H拉伸振動[18]，與Cr(Ⅵ)反應后的紅外光譜圖O-H拉伸移至較高的頻率3 417 cm-1.在1 680～1 630 cm-1、1 545～1 530 cm-1處的改變與酰胺I的C=O拉伸和酰胺II的N-H的拉伸振動有關[19]，此處反應前分別為1 635和1 540，反應后的特征峰發生漂移變為1 646和1 546 cm-1.胺分子中的C-N鍵伸縮振動區為1 360～1 020cm-1，此范圍內吸收峰由1 216和1 072 cm-1分別變為了1 238和1 078 cm-1.從以上結果可以看出，羧基、酰胺Ⅰ(C=O鍵)、酰胺Ⅱ(N-H鍵)、C-N鍵可能參與了生物吸附過程.

圖9 纖維微菌C6吸附Cr(Ⅵ)前后的SEM分析 (a)吸附前;(b)吸附后.Fig.9 SEM images of Cellulosimicrobium sp. strain C6 (a) Before adsorption; (b) after adsorption.

圖10 纖維微菌C6吸附Cr(Ⅵ)前后傅里葉紅外光譜分析 Fig 10 FTIR analysis before and after removal Cr(Ⅵ) by Cellulosimicrobium sp. strain C6

4 討 論

隨著重金屬污染問題日益嚴重，新型的微生物修復技術有著越來越重要的地位，微生物修復技術具有以下優點：修復效果較理想、操作簡便、成本低廉、環境友好等[16].本研究對成都市雙流區某皮革廠附近污染土壤進行分離和純化，得到一株菌株：纖維微菌C6.單因素實驗結果表明，纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)具有較高的去除能力.響應面法是一種可靠的、功能強大的生物吸附過程中建模和優化工具[20].根據單因素試驗的結果，基于Box-Behnken設計的響應面法通過纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)去除條件的優化，建立了響應與自變量之間的關系.結果表明，實驗模型與實驗數據擬合良好，同時溫度和接觸時間是影響生物吸附過程中最重要的參數.掃描電鏡表明，細菌表面有顆粒狀沉淀，可能是通過吸附作用達到對Cr(Ⅵ)的去除效果.紅外光譜也證明了與Cr(Ⅵ)反應后，細胞表面的羧基、酰胺Ⅰ(C=O鍵)、酰胺Ⅱ (N-H鍵)、C-N鍵可能參與了生物吸附過程.Karthik等人[18]也對纖維微菌屬的菌株去除Cr(Ⅵ)的機理進行過討論，溶液中Cr(Ⅵ)通過與細胞表面官能團的配位而被吸附在細胞表面，形成顆粒狀沉淀，再通過轉運蛋白的轉運進入細胞內部，進行細胞內部的積累.此前尹華等[21]研究表明紅螺菌R-04對Cr(Ⅵ)吸附率為84%，根霉菌對Cr(Ⅵ)吸附率為60%～80%，而本研究中纖維微菌C6對Cr(Ⅵ)的去除效率高達95.75%，表明纖維微菌C6具有優異的Cr(Ⅵ)去除性能，在去除水體重金屬污染中具有較大的優勢.現在已經有相關研究對去除污染物的微生物進行固定化處理從而制備成具有高效去除能力的固定化生物吸附劑，該技術有利于將游離的微生物菌體固定起來達到對水體中重金屬的去除[22]，本研究中篩選的菌株也具有進一步開發和應用的價值.