不同醇化方式對片煙細菌群落結構的影響

陳善義 陳義強

摘 要：為明確不同醇化方式的片煙細菌群落結構差異，以3個等級的片煙為材料，采用氣調醇化和自然醇化2種方式進行倉儲養護，以初始樣為對照，利用MiSeq高通量測序對2種醇化方式的片煙細菌群落結構進行分析。結果表明，醇化3年后，2種醇化方式片煙中細菌的多樣性水平降低，且氣調醇化法低于自然醇化法;據非度量多維尺度分析，2種醇化方式的樣品能明顯地區分開來;甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬占比在醇化過程中呈下降之勢，在2種醇化方式之間的差異不顯著;鹽單胞菌屬占比呈上升之勢，且氣調醇化顯著高于自然醇化。

關鍵詞：微生物區系;煙草;倉儲養護;氣調醇化;自然醇化

中圖分類號 TS441文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）11-0051-02

片煙的醇化是指在一定條件下，通過煙葉自身的微生物作用、酶的催化和氧化作用，使煙葉中一些不利于吸食品質的化學物質轉化為對感官質量有利的物質，達到提高煙葉使用價值的過程。片煙的倉儲醇化主要有2種方法：自然醇化法和氣調醇化法。自然醇化法操作簡便，成本低。但在實踐中存在片煙易于發生霉變和蟲蛀等現象，以及醇化周期不易調控、質量最佳狀態保持時間較短等不足之處。氣調醇化法是在密封環境下，通過人工調控氧氣的含量，達到防霉、殺蟲、延長片煙儲存品質時間的目的。對2種醇化方式差異的研究，目前主要集中在外觀質量、感官質量和常規化學成分、pH方面[1-4]。陳善義等[5]研究了氣調醇化過程中片煙細菌群落結構變化規律，但關于2種醇化方法片煙細菌區系差異的研究尚不多見。為此，本研究利用MiSeq高通量測序技術分析氣調醇化和自然醇化的片煙細菌群落結構的差異，旨在為片煙氣調養護的優化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗片煙樣品產地為貴州（代號GZ）、福建（代號FJ）、河南（代號HN）。片煙于廈門東孚煙葉倉庫（倉庫環境年平均氣溫和相對濕度分別為25℃和58%）采用氣調醇化和自然醇化2種方式進行倉儲養護。片煙入庫后立即取樣作為初始樣（代號為O）。氣調醇化的操作按《片煙貯存養護氣調貯存法》YC/T 322—2018[6]相關要求進行。自然醇化則將片煙按200Kg/箱的規格進行裝箱打包后，于片煙倉庫中自然條件下醇化。醇化3年后分別取樣（氣調醇化代號為A，自然醇化代號為N）。

1.2 試驗方法 樣品基因組DNA的提取、PCR擴增、MiSeq測序、數據處理與分析參考包可翔等[7]及陳善義等[5]的研究。

2 結果與分析

2.1 細菌物種的多樣性 由表1可知，氣調醇化3年的樣品Chao值小于初始樣及自然醇化3年的樣品，表明氣調醇化3年后的樣品細菌物種豐富度最小;樣品Shannon指數均值大小排列為初始樣>自然醇化（3年）>氣調醇化（3年），且三者之間的差異極顯著，這說明醇化3年后的片煙細菌物種多樣性低于初始水平，且氣調醇化法醇化的片煙細菌多樣性水平最低。

2.2 屬水平細菌群落的結構差異 由圖1可知，初始樣、氣調及自然醇化法醇化后3年的片煙表面的細菌菌群，主要由甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、Aureimonas、假單胞菌屬、大腸志賀氏桿菌、葡萄球菌屬、鹽單胞菌屬組成。甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬占比在醇化3年后的樣品中顯著低于初始樣，而在自然醇化和氣調醇化樣品之間的差異不顯著;鹽單胞菌屬占比在初始樣、自然醇化及氣調醇化后3年的樣品中差異極顯著，其占比排列為氣調醇化（3年）>自然醇化（3年）>初始樣（表2）。這說明在屬分類水平上，相較于初始樣而言，醇化3年后片煙的細菌群落結構發生了巨大的變化，表現為：甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬占比顯著下降;而鹽單胞菌屬占比顯著提高，且氣調醇化其菌群占比顯著高于自然醇化。

2.3 NMDS分析 非度量多維尺度（Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS）分析通過描述樣品間的距離遠近關系，進一步說明了樣品間細菌群落結構的相似性和差異性。由圖2可知，同一種處理的樣品在NMDS二維圖上距離較近（除初始樣的HN-O樣品之外），不同處理的樣品距離較遠，這說明片煙細菌群落結構在不同處理間差異大于同一處理內樣品之間的差異;此外，自然醇化3年后和氣調醇化3年后的樣品與初始樣的樣品距離較大，說明醇化3年后，片煙細菌的群落結構相較于初始樣變化較大。

3 討論

利用MiSeq高通量測序分析了氣調醇化及自然醇化3年后的片煙與初始樣中細菌的物種多樣性和群落結構差異，發現醇化3年后的片煙細菌物種豐富性和多樣性水平降低，這與伍雪瑩等[8]、楊金奎等[9]對陳化烤煙微生物的變化研究結果一致。周家喜等[10]對煙葉陳化過程細菌群落演替特征的研究中發現，甲基桿菌屬的豐度隨醇化過程的進行呈下降之勢，鞘氨醇單胞菌屬則呈上升之勢，而本研究發現上述2個菌屬占比均低于初始水平。造成這一差異的可能的原因是周家喜等[10]的研究主要關注醇化24個月以內的時期，而本研究關注醇化36個月后的細菌區系。本研究發現，醇化3年后，2種醇化方式片煙細菌群落結構的差異主要表現在鹽單胞菌屬的占比上。鹽單胞菌屬屬于鹽單胞菌科，是一類能在絕對鹽度（NaCl）為0～32%條件下生長的耐鹽細菌[11]。醇化較久的煙葉，是否在微生物的代謝過程中生成一些鹽類物質尚不清楚。鹽單胞菌屬在煙葉醇化過程中的作用，以及不同醇化方式的片煙有關鹽類物質含量的差異有待進一步的研究。

4 結論

片煙在醇化過程中，細菌群落結構發生了顯著的變化，甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬占比下降，鹽單胞菌屬占比上升;自然醇化和氣調醇化片煙細菌的群落結構差異主要表現在鹽單胞菌屬占比上，且氣調醇化高于自然醇化。

參考文獻

[1]楊欣玲，楊永鋒，張俊嶺，等.氣調貯存技術對片煙醇化質量的影響[J].河南農業科學，2017，46（10）：153-159.

[2]張明乾，范堅強，包可翔，等.四段式氣調貯存與常規貯存條件下烤煙片煙的質量差異分析[J].安徽農學通報，2020，26（02-03）：39-41.

[3]黃立兵，曾經緯，吳讓新，等.氣氛調控養護對片煙醇化質量的影響[J].安徽農業科學，2017，45（3）：86-89.

[4]何偉，范堅強，牟文君，等.片煙四段式氣調綠色醇化技術體系的構建[J].中國煙草學報，2020，26（6）：32-44.

[5]陳善義，李菁菁，林儉，等.基于高通量測序的不同產地和部位自然醇化片煙真菌群落結構分析[J].煙草科技，2018，51（4）：12-19.

[6]國家煙草專賣局.片煙氣調貯存養護技術規范：YC/T322—2018[S].北京：中國標準出版社，2019.

[7]包可翔，林儉，何偉，等.不同產地和部位對片煙自然醇化過程中細菌群落結構的影響[J].煙草科技，2017，50（4）：10-17.

[8]伍雪瑩，梁書利，韓雙艷，等.不同陳化期烤煙葉表細菌的多樣性及發育分析[J].廣東農業科學，2014，41（18）：28-33，38.

[9]楊金奎，段焰青，陳春梅，等.醇化煙葉表面可培養微生物的鑒定和系統發育分析[J].煙草科技，2008（11）：51-55.

[10]周家喜，喻理飛，張健，等.煙葉陳化過程細菌群落演替特征[J].生態學報，2018，38（21）：7739-7748.

[11]朱鳳玲，曲凌云，洪旭光，等.鹽單胞茵屬一新種的分離與鑒定[J].海洋科學進展，2011，29（2）：221-228.

（責編：王慧晴）