兔源F型多殺性巴氏桿菌雙重PCR檢測方法的建立

王錦祥，孫世坤，陳巖峰，陳冬金，桑 雷，謝喜平

（福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】兔巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌感染兔引起的一種傳染病。該病一年四季均可發生，且所有日齡的兔均可發病。臨床上，兔巴氏桿菌病以呼吸道癥狀多見，也可見中耳炎和結膜炎[1?2]。該病是兔的常發病和多發病，是危害兔產業發展的重要疾病。根據多殺性巴氏桿菌的莢膜抗原可將其分為5種血清型，即A、B、D、E和F型[3]。其中，A和D型菌株是兔群中的優勢流行菌株[4?5]?！厩叭搜芯窟M展】F型多殺性巴氏桿菌最早在美國的火雞中發現[6]，該菌株主要感染禽類[7]，其感染能引起禽霍亂[8]。然而，研究表明國內外兔群中也存在F型多殺性巴氏桿菌，且該菌株對兔具有強致病性[9?11]。由此可見，兔群中F型多殺性巴氏桿菌的出現，使兔巴氏桿菌病的病因更加復雜，也使該病的確診更加困難。因此，實現對F型多殺性巴氏桿菌的快速檢測，掌握其在兔群中的流行情況，對兔產業的發展具有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c】目前，用于F型多殺性巴氏桿菌的實驗室檢測方法有細菌分離鑒定和多重PCR[3,10]。多殺性巴氏桿菌營養需求高、生長較緩慢，容易受其他生長較快的細菌污染。多重PCR用于多殺性巴氏桿菌的莢膜分型[3]，反應體系中包含6對引物，對反應體系的組成和反應條件都要求很高，否則會出現非特異性擴增或假陰性結果。【擬解決的關鍵問題】為了建立一種快速且簡便的F型多殺性巴氏桿菌檢測方法，本研究根據多殺性巴氏桿菌kmt1基因和F型多殺性巴氏桿菌fcbD基因的保守序列分別設計了2對特異性引物，建立了檢測F型多殺性巴氏桿菌的雙重PCR檢測方法，為兔源F型多殺性巴氏桿菌的快速檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 2×PCR Mix、pEASY-T1克隆載體、細菌基因組DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒購自 北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 菌株 兔源A、D和F型多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）、支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica）、肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumonia）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由本實驗室分離保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據GenBank中公布的多殺性巴氏桿菌kmt1基因（登錄號：KX348143）和F型多殺性巴氏桿菌的fcbD基因（登錄號：AF302467），利用Primer Premier 5.0軟件設計了2對分別針對kmt1基因和fcbD基因保守序列的特異性引物，kmt1基因引物序列為：kmt1-F：5′-gttttatgccacttgaaatgggaa-3′/kmt1-R：5′-taagaaacgtaactcaacatggaaatatt-3′；fcbD基因引物序列為：fcbD-F：5′-ctaaagatcttgttcttgctccattg-3′/fcbD-R：5′-tctgcggtaatattatgagtatccac-3′，擴增的目的片段分別為260 bp和490 bp。引物由上海鉑尚生物技術有限公司合成。

1.2.2 單重PCR方法的建立及擴增產物的鑒定 以提取的兔源F型多殺性巴氏桿菌基因組DNA為模板，分別利用kmt1基因和fcbD基因引物進行單重PCR擴增。單重PCR反應體系為：2×PCR Mix 25 μL，基因組DNA 1 μL，上下游引物（10 μmol·L?1）各2 μL，滅菌ddH2O 20 μL，共50 μL反應體系。單重PCR反應程序為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物純化后克隆至pEASY-T1克隆載體，送上海鉑尚生物技術有限公司測序。

1.2.3 雙重PCR方法的建立及反應條件的優化 將kmt1基因和fcbD基因引物調整至40 μmol·L?1，等體積混勻后作為雙重PCR的引物。雙重PCR反應體系為：2×PCR Mix 25 μL，兔源F型多殺性巴氏桿菌基因組DNA 1 μL，混合引物4 μL，滅菌ddH2O 20 μL，共50 μL反應體系。雙重PCR反應程序為95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s、59 ℃ 90 s、72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃10 min。在此基礎上，設置雙重PCR方法的退火溫度在54～60 ℃、混合引物終濃度在0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 μmol·L?1進行優化，確定最佳的退火溫度和引物濃度。

1.2.4 雙重PCR方法的特異性試驗 分別以提取的兔源A、D和F型多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板，應用建立的雙重PCR方法進行檢測，設置陰性對照（滅菌ddH2O），評估該雙重PCR方法的特異性。

1.2.5 雙重PCR方法的敏感性試驗 將莢膜F型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA 10倍倍比稀釋，使雙重PCR反應體系中DNA模板的含量為1×107～1×100拷貝·μL?1，設置陰性對照（滅菌ddH2O），評估該方法的敏感性。

1.2.6 雙重PCR方法的重復性試驗 取90份已知結果的病死兔肺臟樣品，平均分為3組，每組30份（A型多殺性巴氏桿菌樣品5份，D型多殺性巴氏桿菌5份，F型多殺性巴氏桿菌5份，支氣管敗血波氏桿菌3份，肺炎克雷伯菌3份，大腸桿菌3份，金黃色葡萄球菌3份，陰性樣品3份）。利用細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取樣品的基因組DNA，平均分為3份，利用建立的雙重PCR方法分3次檢測（每次檢測90份），每次檢測時每份樣品重復3次，統計批內和批間變異系數，評估該雙重PCR方法的重復性。

1.2.7 雙重PCR方法的初步應用 選取從龍巖、三明、南平、福州和寧德5個地區收集的87份已知結果的呼吸道病死兔肺臟樣品，應用本實驗建立的雙重PCR方法和已報道的多重PCR方法[3]同時對87份臨床樣品進行檢測。統計檢測結果，比較兩種PCR方法檢測結果與已知結果的一致性以及兩種PCR方法檢測結果的一致性。

2 結果與分析

2.1 單重PCR方法的建立及擴增產物的鑒定

以兔源F型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA為模板，利用設計的kmt1基因和fcbD基因引物分別進行單重PCR擴增。結果顯示，擴增產物分別為260 bp和490 bp（圖1），與預期目的片段大小相符。將上述2條目的片段克隆至pEASY-T1克隆載體并測序，測序結果顯示2條目的片段序列與相應參考基因的序列同源性均為100%。

圖1 單重PCR擴增結果Fig. 1 Detection by single PCR amplification

2.2 雙重PCR方法的建立及反應條件的優化

以兔源F型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA為模板，應用kmt1基因和fcbD基因引物進行雙重PCR擴增。結果顯示，在同一反應體系中，2對引物均能特異地擴增出相應的目的片段（圖2）。在此基礎上，進一步對雙重PCR的退火溫度和引物濃度進行優化。結果顯示，當退火溫度為54～60 ℃時，該雙重PCR的擴增效果均較好（圖3）；當混合引物濃度為0.8 μmol·L?1時（圖4），雙重PCR擴增效果最好。退火溫度高，則特異性強。因此，確定該雙重PCR的最佳反應條件為退火溫度60 ℃，混合引物濃度0.8 μmol·L?1。

注：M:DNA Marker; 1:kmt1和fcbD基因; 2:陰性對照 。Note: M: DNA marker; 1: kmt1 and fcbD genes; 2: negative control.

圖3 雙重PCR方法反應溫度的優化Fig. 3 Optimization on reaction temperature for duplex PCR assay

圖4 雙重PCR檢測方法引物濃度優化Fig. 4 Optimization on primer concentration for duplex PCR assay

2.3 雙重PCR方法的特異性

利用建立的雙重PCR能同時特異地擴增出兔源F型多殺性巴氏桿菌的kmt1基因片段和fcbD基因片段，能擴增出兔源A型和D型多殺性巴氏桿菌的kmt1基因片段，對兔源支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和陰性對照（滅菌ddH2O）則為陰性（圖5）。結果表明，該雙重PCR方法具有較強的特異性。

圖5 雙重PCR檢測方法特異性試驗Fig. 5 Specificity of duplex PCR assay

2.4 雙重PCR方法的敏感性

將兔源F型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA 10倍倍比稀釋（1×107～1×100拷貝·μL?1）。結果顯示，該雙重PCR的最低檢測限為1×103拷貝·μL?1基因組 DNA（圖6），表明該雙重PCR具有良好的敏感性。

圖6 雙重PCR檢測方法敏感性試驗Fig. 6 Sensitivity of duplex PCR assay

2.5 雙重PCR方法的重復性

應用建立的雙重PCR對90份已知結果的病死兔肺臟樣品（3組，每組30份）分3批次進行批內和批間重復性試驗。結果顯示，重復性試驗批內和批間結果均一致，表明該雙重PCR具有良好的重復 性。

2.6 雙重PCR方法的初步應用

>應用建立的雙重PCR方法和已報道的多重PCR方法同時對87份已知結果（A型多殺性巴氏桿菌陽性樣品30份，D型多殺性巴氏桿菌陽性樣品應用建立的雙重PCR方法和已報道的多重PCR方法同時對87份已知結果（A型多殺性巴氏桿菌陽性樣品30份，D型多殺性巴氏桿菌陽性樣品9份，F型多殺性巴氏桿菌陽性樣品8份，支氣管敗血波氏桿菌陽性樣品11份，肺炎克雷伯菌陽性樣品2份，大腸桿菌陽性樣品1份，金黃色葡萄球菌陽性樣品3份，陰性樣品23份）的呼吸道病死兔肺臟樣品進行檢測。結果顯示，雙重PCR檢測出多殺性巴氏桿菌陽性樣品49份（其中F型多殺性巴氏桿菌陽性樣品8份），陰性樣品38份。多重PCR檢測出多殺性巴氏桿菌陽性樣品43份（其中A型多殺性巴氏桿菌陽性樣品30份，D型多殺性陽性樣品7份，F型多殺性巴氏桿菌陽性樣品6份），陰性樣品39份，非特異擴增樣品5份。雙重PCR方法檢測結果和已報道的多重PCR方法檢測結果與已知結果的符合率分別為97.70%和94.25%。雙重PCR方法檢測結果與已報道的多重PCR方法檢測結果的符合率為93.10%。上述結果表明，本試驗建立的雙重PCR方法準確性高，具有較好的臨床應用價值。

3 討論與結論

多殺性巴氏桿菌感染是引起兔呼吸道疾病的重要病原之一，常常引起致死性感染。臨床上，致死性病例以50～70日齡的商品兔、懷孕后期母兔和哺乳母兔多見，給養兔業造成嚴重的經濟損失[12]。兔巴氏桿菌病主要由A和D型多殺性巴氏桿菌感染引起[4?5]。F型多殺性巴氏桿菌首次分離自火雞[6]，主要在禽類中流行病且致病性強[7?8]。然而，在國內外兔群中也發現有該菌的存在，且其感染能引起兔的嚴重致死性呼吸道疾病[9?11]。由此可見，F型多殺性巴氏桿菌在兔群中的出現使兔巴氏桿菌病病因更加復雜，導致該病的確診更加困難。

本試驗根據多殺性巴氏桿菌的kmt1基因和F型多殺性巴氏桿菌fcbD基因的保守序列分別設計了2對特異性引物，建立了檢測F型多殺性巴氏桿菌的雙重PCR方法。kmt1基因是多殺性巴氏桿菌的種特異性基因，以該基因為目的基因能建立檢測多殺性巴氏桿菌的特異性PCR檢測方法[13?14]。fcbD基因編碼F型多殺性巴氏桿菌莢膜中的軟骨素，是F型菌株中的特異性基因，以該基因為目的基因能建立鑒定F型多殺性巴氏桿菌莢膜血清型的多重PCR方法[3]。由此可見，以kmt1基因和fcbD基因為目的基因能建立特異的檢測兔源F型多殺性巴氏桿菌的雙重PCR檢測方法。本試驗建立的雙重PCR方法快速簡便，不僅克服了細菌分離鑒定的費時，還克服了多殺性巴氏桿菌莢膜分型多重PCR方法的費力。此外，該雙重PCR方法特異性強、重復性好、準確性高，具有很好的臨床應用價值，為掌握兔群中F型多殺性巴氏桿菌的流行情況提供了有力的技術手段。