水稻葉綠體基因CPN60-β多克隆抗體的制備

蘭漢紅，陳海煌，黃偉鑫，何昕翼

（閩南師范大學生物科學與技術(shù)學院，福建 漳州 363000）

0 引言

【研究意義】水稻條紋葉枯病是由水稻條紋病毒（Rice stripe virus, RSV）引起的重大病害，曾在中國16個省市和自治區(qū)暴發(fā)，給水稻生產(chǎn)帶來巨大危害，嚴重威脅著我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食安全[1]。然而，當前對該病毒病的防控仍缺乏有效的措施。RSV屬于纖細病毒屬（Tenuivirus）病毒，其基因組為單鏈RNA（singal strain RNA, ssRNA）。對RSV的編碼策略研究表明，其基因組RNA1為負鏈編碼，RNA2、RNA3和RNA 4均為雙義編碼。RNA1互補鏈編碼復制相關(guān)蛋白RdRp[2]；RNA2毒義鏈及其互補鏈分別編碼沉默抑制子蛋白NS2和介體傳毒相關(guān)蛋白NSvc2[3]；RNA3毒義鏈及其互補鏈分別編碼沉默抑制子NS3和外殼蛋白CP[4?5]；RNA4毒義鏈及其互補鏈分別編碼病害特異蛋白SP和運動蛋白NSvc4[6?7]。病毒編碼的蛋白較少，為了完成復制循環(huán)，病毒常與寄主的蛋白因子相互作用。因此，加深RSV與寄主的互作對于病毒病害的綠色防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，小麥矮縮病毒的復制酶蛋白A與小麥文庫中的GRAB互作，GRAB的表達抑制小麥矮縮病毒在小麥種的復制增殖；唐超等[9]研究發(fā)現(xiàn)，小西葫蘆黃花葉病毒RNA多聚酶蛋白能夠與PABP氨基酸C端特異互作；Soellick等[10]研究發(fā)現(xiàn)，番茄斑萎病毒編碼的運動蛋白NSm能夠與煙草和擬南芥的DnaJ蛋白特異互作；Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)，番茄花葉病毒的外殼蛋白能夠與激發(fā)子反應蛋白特異互作，該蛋白基因沉默后，病毒的外殼蛋白無法長距離運動，這結(jié)果說明兩者的特異互作對于病毒的運動是必須的；Desvoyes等[12]研究發(fā)現(xiàn)，番茄叢矮病毒的運動蛋白P22能夠與亮氨酸拉鏈同源結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白特異互作，病毒的感染能夠顯著提高蛋白基因的表達水平。【本研究切入點】前人研究表明，RSV編碼的運動蛋白NSvc4在模式植物煙草中參與病毒的長距離、胞間運動以及本氏煙感病癥狀的形成[8,13?15]，證明NSvc4參與病毒的運動和致病等侵染過程。但是NSvc4的運動或致病機制仍然不是很明確。在前期的酵母雙雜交試驗中，筆者發(fā)現(xiàn)NSvc4與水稻葉綠體相關(guān)的一個蛋白-RuBisCO亞基結(jié)合蛋白Chaperonin-60-beta（CPN60-β）能夠特異互作。猜測CPN60-β蛋白在NSvc4蛋白的運動和致病過程中發(fā)揮重要作用。但是，目前還缺乏針對CPN60-β的特異抗體，阻礙了對CPN60-β蛋白在細胞內(nèi)定位情況、如何發(fā)揮功能等相關(guān)問題的探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】制備與RSV運動和致病過程有關(guān)的NSvc4蛋白的互作蛋白水稻葉綠體蛋白的RuBisCO亞基結(jié)合蛋白Chaperonin-60-beta（CPN60-β）多克隆抗體。明確CPN60-β基因原核表達條件，獲得水稻葉綠體CPN60-β蛋白的多克隆抗體，用于后續(xù)研究CPN60-β蛋白在RSV編碼的NSvc4蛋白介導的病毒運動和致病過程中的調(diào)控功能及作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

原核表達載體pET-28a（+）由本課題組實驗室保存。植物組織總RNA快速提取試劑盒（RNA Easy Fast Plant Tissue Kit）和 質(zhì) 粒 小 量 快 速 抽 提 試 劑 盒（TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit）等購自北京天根生化科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶和聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastKing One Step RT-PCR Kit）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；弗氏佐劑購自美國Sigma-Aldrich公司；鼠源6×His單克隆抗體購自美國Proteintech Group公司。

1.2 原核表達載體構(gòu)建

將水稻葉綠體相關(guān)基因CPN60-β序列在NCBI網(wǎng)站進行同源性比對，以Primer5.0設計特異性引物CPN60-β-Forward：5′-TATAGGATCCACCGCA AAAGCACTG GTT G-3′（斜體加下劃線字體為酶切位點BamHI，加粗字體為保護堿基）和CPN60-β-Reverse：5′ -TA TACTCGAGGCGCTCGTTCAGTTTCTC-3′（斜體加下劃線字體為酶切位點XhoI，加粗字體為保護堿基）。用植物組織總RNA快速提取試劑盒提取水稻幼嫩葉片總RNA后，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RT-PCR。反應體 系50 μL：RNA模 板0.1 μg，RT-PCR MasterMix buffer 25 μL，RT-PCR Enzyme Mix buffer 2 μL，上下游引物各1.5 μL，ddH2O補足至50.0 μL。PCR反應條件：42 ℃ 30 min；95 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 40 s、70 ℃ 40 s，40個循環(huán)；70 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物和表達載體pET-28a（+）都用BamH ?和XhoI進行37 ℃雙酶切過夜。酶切體系為：RT-PCR產(chǎn)物或者 表達載體質(zhì) 粒2 μL，Buffer 1 μL，BamH ?和XhoI各0.5 μL，ddH2O補足至10 μL。酶切產(chǎn)物回收后與T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜，連接體系為：表達載體質(zhì)粒3 μL，RT-PCR酶切產(chǎn)物5 μL，T4 DNA連接酶1 μL，Buffer 0.5 μL，ddH2O補足至10 μL。連接后，將產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化大腸感覺感受態(tài)細胞DH5α，涂布LB瓊脂培養(yǎng)平板，然后挑取培養(yǎng)平板單克隆進行PCR和測序驗證，正確的重組表達載體命名為pET-CPN60-β。

1.3 CPN60-β基因的原核表達與檢測鑒定

將重組表達載體pET-CPN60-β熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞并涂布于含卡那霉素（50 μg·mL?1）的LB固體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后挑取單克隆接種到LB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素50 μg·mL?1）中，37 ℃、220 r·min?1振蕩培養(yǎng)12 h。第2 d按照1∶100倍比稀釋后置于37 ℃、220 r· min?1振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600約為0.6～0.8），添加誘導劑IPTG 0.5 mmol·L?1，在37 ℃和220 r· min?1振蕩培養(yǎng)條件下誘導目的基因表達3.5 h。12 000 r·min?1離心沉淀細胞，超聲波裂解細胞適當時間，SDS-PAGE凝膠電泳跑膠，將膠進行考馬斯染色初步確定CPN60-β基因是否表達。pET-CPN60-β重組質(zhì)粒帶有6×His標簽，如果CPN60-β基因成功表達，那么CPN60-β蛋白和6×His能夠融合表達，所以可以用His抗體檢測鑒定目的基因是否成功表達。不同濃度的IPTG誘導表達pET-CPN60-β重組載體后，收集菌體蛋白進行Western blotting檢測目的蛋白是否成功表達。以抗6×His抗體為一抗、辣根過氧化物酶HRP標記抗體為二抗，進行Western blot試驗，鑒定CPN60-β蛋白是否融合6×His標簽，從而進一步鑒定CPN60-β基因是否表達。在SDS-PAGE和Western blot試驗過程中均設置不加IPTG的對照組。

1.4 抗血清的制備、純化、效價和濃度測定

純化CPN60-β蛋白，將其和一定量的弗氏完全佐劑充分混勻和乳化，乳化后免疫5月齡的雄性新西蘭大白兔；隨后每隔15 d加強免疫4～5次。為了監(jiān)測免疫過程中是否產(chǎn)生抗體，在蛋白免疫前和第2次加強免疫后第15 d分別抽血采樣15 mL，將血液樣品在4 ℃冰箱靜止保存過夜。為了收集血樣中的抗血清，將血樣在8 000 r min?1離心20 min。隨后，將抗血清按照1∶500、1∶2 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶100 000和1∶1 000 000的稀釋比例稀釋，然后在室溫條件下孵育一抗60 min，孵育二抗 50 min，顯色30 min。

在第4次加強免疫后15 d，采集兔子全血60 mL，按上述方法獲取血清。將蛋白Beads添加至純化柱子后，收集好的抗血清添加至柱子內(nèi)部，室溫條件下或者4 ℃冰箱和Beads共孵育；孵育結(jié)束后用PBS緩沖液沖洗5次；然后用洗脫液洗脫收集抗血清蛋白。采用上述ELISA方法檢測純化后抗血清的效價。將CPN60-β融合蛋白免疫大白兔前所采的血設為陰性對照。為了避免動物死亡，設置2個平行試驗，即免疫2只動物。

抗體結(jié)構(gòu)中重鏈和輕鏈分子大小分別為55 kDa和25 kDa，因此，可通過還原性SDS-PAGE分離后考馬斯顯色觀察抗體重蓮含量來檢測抗體的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因CPN60-β的擴增與表達載體構(gòu)建

以水稻幼嫩葉片總RNA為模板、CPN60-β-Forward/CPN60-β-Reverse為引物，RT-PCR擴增水稻葉綠體基因CPN60-β。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，目的基因片段CPN60-β的大小大約為657 bp（圖1-A）。目的基因經(jīng)過克隆轉(zhuǎn)化后，任意選取LB固體培養(yǎng)基平板上的單克隆菌落，PCR鑒定陽性單菌落。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，成功重組的質(zhì)粒pET-CPN60-β能夠擴增出大小約為657 bp的目的基因CPN60-β片段（圖1-B）。陽性重組質(zhì)粒pET-CPN60-β送至廣州生工基因股份有限公司測序，以驗證序列正確與否。

圖1 重組質(zhì)粒pET-CPN60-β構(gòu)建Fig. 1 Construction of recombinant plasmid pET-CPN60-β

2.2 葉綠體基因CPN60-β的表達與鑒定

重組質(zhì)粒pET-CPN60-β轉(zhuǎn)化表達菌BL21后，為了明確CPN60-β基因是否在大腸桿菌BL21能夠誘導表達，將誘導表達條件設置為：誘導劑IPTG濃度0.5 mmol·L?1、搖床溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速220 r· min?1、振蕩培養(yǎng)3.5 h進行誘導表達。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，在此誘導表達條件下，重組質(zhì)粒表達約30 kDa的蛋白條帶，而不添加IPTG的對照中并未出現(xiàn)特異蛋白條帶（圖2-A），該結(jié)果初步表明重組質(zhì)粒pET-CPN60-β能夠表達分子量約30 kDa的CPN60-β融合蛋白。為了進一步驗證CPN60-β是否表達，以抗6×His抗體為一抗、辣根過氧化物酶HRP標記抗體為二抗進行Western blot試驗，結(jié)果表明，在誘導表達組中，在30 kDa處6×His抗體能夠特異結(jié)合其抗原6×His進而顯色，而不添加IPTG的對照中在相應位置并未結(jié)合和顯色（圖2-B）。因為CPN60-β融合了6×His，所以該結(jié)果進一步表明CPN60-β融合蛋白能夠成功誘導表達。

圖2 CPN60-β基因的表達與鑒定Fig. 2 Expression and confirmation of CPN60-β gene

2.3 抗CPN60-β抗體的效價和濃度

為了監(jiān)測免疫過程中是否產(chǎn)生抗CPN60-β多克隆抗體，在蛋白免疫前和第2次加強免疫后采集少量血樣，收集血清，倍比稀釋后采用ELISA檢測免疫前和加強免疫后（未純化）的抗血清效價。ELISA檢測結(jié)果表明，與免疫前和空白對照相比，未純化加強免疫后的抗血清隨著稀釋比例加大，ELISA顯色越來越弱；稀釋比例達到1∶1 000 000顯色反應仍然可見（圖3-A），表明未純化的加強免疫后抗血清的效價為1∶1 000 000。

為了明確多克隆抗體純化前后的效價，多克隆抗體經(jīng)親和配體純化、倍比稀釋后，以ELISA檢測其抗體效價。ELISA檢測結(jié)果顯示，與純化前的抗血清對照相比，在相同倍比稀釋下，純化后的抗體ELISA顯色反應明顯比較深，該結(jié)果說明抗體經(jīng)過純化后其濃度得到有效的提高（圖3-B）。此外，多克隆抗體純化前后在倍比稀釋達到1∶1 000 000時，ELISA顯色反應仍然較為明顯，說明純化后的抗體效價都達到1∶1 000 000（圖3-B）。然而，洗脫液ELISA反應不顯色，表明抗體大部分被純化（圖3-B）。

圖3 抗CPN60-β抗體的效價測定Fig. 3 Titer of antibodies against CPN60-β

抗體結(jié)構(gòu)中重鏈和輕鏈分子大小分別為55 kDa和25 kDa。因此，抗體通過變性或還原性SDS-PAGE分離后考馬斯顯色可觀察抗體重鏈含量從而檢測抗體的濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測后抗體的含量約為300 μg·mL?1（圖4）。

圖4 變性SDS-PAGE檢測抗CPN60-β抗體濃度Fig. 4 Antibody concentration estimated by denatured SDSPAGE

3 討論

前人的研究結(jié)果表明，RSV編碼的運動蛋白NSvc4在模式植物煙草中參與病毒的長距離、胞間運動，以及本氏煙感病癥狀的形成[8,13?14]，證明NSvc4參與病毒的運動和致病等侵染過程。但是NSvc4的運動或致病機制仍未明確。因此，加深NSvc4與寄主水稻的互作機理的研究和了解，對于病毒侵染機制和病毒病害的綜合綠色防治具有重要意義。病毒編碼的蛋白數(shù)量有限，其必須招募或者利用寄主細胞內(nèi)的蛋白來完成侵染過程。筆者在酵母雙雜交試驗中發(fā)現(xiàn)，NSvc4與水稻葉綠體相關(guān)的一個蛋白——RuBisCO亞基結(jié)合蛋白Chaperonin-60-beta（CPN60-β）能夠特異互作。因此，猜測CPN60-β蛋白在NSvc4蛋白介導的RSV在寄主中的運動和致病過程中發(fā)揮重要作用。但是，目前還缺乏針對CPN60-β蛋白的特異抗體，阻礙了CPN60-β蛋白在細胞內(nèi)定位、發(fā)揮作用機制等問題的研究。本試驗制備的水稻CPN60-β多克隆抗體有助于研究CPN60-β蛋白在RSV病毒運動和致病過程中的功能。

目前，通過蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體的方法具有成熟、簡單，周期短等優(yōu)點[15]。多克隆抗體能夠制備成功的關(guān)鍵點為能否正確選取抗原蛋白的抗原片段[16]。本研究首先通過分析水稻CPN60-β蛋白分子的抗原指數(shù)、可及性、親水性和疏水性等特性，選取抗原指數(shù)較高的179～422 aa區(qū)段作為抗原。然后擴增目的基因CPN60-β，且成功構(gòu)建原核表達載體pET-CPN60-β并進行高效表達，獲得的CPN60-β融合蛋白經(jīng)Ni2+-NTA瓊脂糖親和層析純化后作為抗原免疫雄性新西蘭大白兔，成功制備獲得抗水稻CPN60-β多克隆抗體，并證實制備獲得的CPN60-β多克隆抗體純度較高，其質(zhì)量濃度和效價分別為300 μg mL?1和1∶1 000 000。CPN60-β抗體的制備為后續(xù)進一步研究CPN60-β在NSvc4介導的RSV運動和致病過程中發(fā)揮的具體機制提供了重要材料。稻谷等糧食是人類賴以生存和發(fā)展的重要物質(zhì)基礎。病毒病一直嚴重影響著我國水稻等糧食生產(chǎn)和糧食安全。糧食安全是關(guān)乎國計民生的頭等大事，我國農(nóng)業(yè)病蟲害多發(fā)，嚴重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量。CPN60-β抗體的制備將有助于加深對RSV NSvc4及其CPN60-β在病毒致病過程中的具體作用機制的理解，并可望通過設計靶位點開發(fā)出針對水稻病毒病的綠色防控技術(shù)。