一株茶渣分解菌Fb的分離及其應用

繆伏榮，陳鑫珠，李忠榮，劉 景

（福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】茶渣是茶飲料、速溶茶和茶單寧產業等加工茶葉后產生的殘渣，據統計，僅茶飲料和速溶茶公司每年產生的茶渣就達16萬t[1]。研究表明，干基的茶渣粗蛋白質含量為17%～25%，是一種良好的蛋白質飼料資源[2－4]。日本的佐野滿昭[5]在飼料中添加3%的茶渣喂養肉雞，可提高雞肉的嫩度和脂溶性抗氧化物（VE、VC）含量，降低雞肉脂質過氧化物含量。徐瑞等[6]研究表明，在日糧中添加2%的茶葉渣能提高育肥豬的生長性能，改善豬肉的色澤和保水性能。吳慧敏[7]研究發現在蛋雞的日糧中添加1%～2%的茶渣不僅顯著增加產蛋數和蛋重觀察蛋雞的生產性能，還能顯著提高血清中的GSH-Px，T-SOD，IgA，IgM含量，同時顯著的降低血清中的膽固醇含量。馬幫軍[8]研究表明，豬日糧中添加茶粉1%～3%會降低豬的平均日增重，但顯著降低豬背膘厚度，減少脂肪在豬胴體中的沉積。潘發明[9]等則認為飼糧中添加茶渣比例過高，會影響適口性，降低綿羊采食量。主要原因是茶渣粗纖維含量高，畜禽纖維素酶活力低，不利于消化吸收；另一原因，剛出產的茶渣水分達到80%不易儲藏和運輸，因此僅有小部分的茶渣作為飼料源利用，絕大部分茶渣被丟棄或掩埋；這不僅造成資源浪費，而且造成生態環境污染[10－11]。【前人研究進展】為了更好利用茶渣資源，劉姝等[12]利用木霉等組合微生物發酵茶渣，在30 ℃下發酵4～8 d后發現，飼料中粗蛋白測定含量＞25%，比對照提高了20%，其營養價值達到了仔豬配合飼料中粗蛋白的含量。胡桂萍等[13]以提取茶多酚后的茶渣為發酵原料，利用乳桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和米曲霉菌進行常溫（25～35 ℃）的厭氧固態發酵5～7 d，測定發現發酵產品中粗蛋白含量達29.49%。倪星虹[14]以混合菌種經溫度28 ℃發酵7 d后，測定發現茶渣發酵產物中蛋白質含量提高了60.78%。朱飛等[1]利用黑曲霉在添加5%玉米粉的茶渣中進行固態發酵，經自然pH、37 ℃、8 d條件下發酵后，茶渣的營養價值顯著提高。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是2005年由Ruiz-Garcia等[15]新命名的一種生防菌，是芽孢桿菌屬的一個新種[16－19]。國內外已有學者研究表明Bacillus veiezensis能產生具有廣譜抗菌活性的次生代謝產物，包括纖維素酶、蛋白酶以及多種抗菌的活性物質，是用來增加作物產量、維護生態環境和農業生態系統的首選生物藥劑[20－26]。貝萊斯芽孢桿也作為水產養殖的益生菌[27]。 Liu X Y等[28]對從海洋微生物中篩選到菌株Bacillus velezensis H3的發酵培養基和拮抗物質進行研究，發現該菌株的活性物質是一種替代性的表面活性素，有較高的研究價值。【本研究切入點】茶渣經發酵后雖然能在一定程度上提高茶渣的營養價值，但發酵溫度均不超過37 ℃，發酵效率低，時間長，易被雜菌污染。因此有必要篩選能適合高效分解茶渣的高溫菌株。但鮮見貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）在降解工農業副產物的研究報道。【擬解決的關鍵問題】本研究從堆積廢棄茶渣中分離獲得既耐高溫又能產生高酶活的貝萊斯芽孢桿菌Fb，對其進行形態學、生理生化以及分子生物學鑒定，同時研究其最適的生長條件，分解茶渣的效果，為后續的茶渣開發研究奠定理論的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

LB培養液（L）：酵母粉10 g，蛋白胨10 g，牛肉浸膏5 g，NaCl 10 g，pH 5.5～6.0。

純化固體培養基：LB培養液中時加入20 g瓊脂粉。

分離固體培養基：取新鮮茶渣50 g加蒸餾水500 ml蒸煮30 min，過濾后的茶渣液定容到200 ml，加入4 g瓊脂粉。

液體發酵培養基：同LB培養液。

茶渣：采集于某地的茶飲料車間。將發酵前后的茶渣烘干，粉碎并過0.25 mm孔徑篩，用四分法取樣100 g。

主要儀器：LRH-250A生化培養箱，CRY-200恒溫搖床，Multiskan MK3酶標儀，FOSS全自動凱氏定氮儀Kjeltec8400，FOSS2010纖維測定儀，menbarPureA300全自動氨基酸分析儀。

試劑：酵母粉、蛋白胨、NaCl等均為AR級、茚三酮染色劑、緩沖液、氨基酸標準液和稀釋液均為 德國menbarPure公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的培養與分離 從某地多年堆積的茶渣處取樣品10 g，加入盛有50 mL LB培養液的250 mL錐形瓶中，在42 ℃、120 r·min－1條件下富集培養24 h，取2 mL培養物接種到新鮮的LB培養液，以相同的條件重復培養3次。富集培養物在分離固體培養基上劃線培養，42 ℃培養24 h。挑取生長明顯的菌落進行復篩。將初篩菌落在純化固體培養基上劃線分離3次，以獲得純培養物，并依據菌種在分離固體培養基的生長情況，挑取有不同形態特征的單菌落，于42 ℃ LB培養基上分別擴繁后加20%甘油混勻 ，于－80 ℃條件下保存。

本研究對2016年1月1日—2017年12月31日于哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院腔鏡科使用超細鼻胃鏡的患者進行回顧性分析，共計160例，年齡36～91歲，男性136例，女性24例，平均年齡分別為61.54±10.34歲和61.38±10.00歲，包含門診與住院患者，患者均一般狀態尚可，在清醒狀態下完成內鏡下診療，無術后并發癥。病變狹窄類型主要為消化道癌癥、術后吻合口良性與復發性狹窄、外壓性狹窄及不明原因性狹窄等，所有患者均因標準胃腸鏡無法通過狹窄處而使用超細鼻胃鏡。電子內鏡均為奧林巴斯生產，標準胃鏡的外徑≤9.8 mm，標準腸鏡的外徑≤12.9 mm，而鼻胃鏡的外徑≤5.8 mm(表1)。

1.2.2 菌株產酶能力測定 將菌株活化24 h后挑取1環至液體發酵培養液中，42 ℃、120 r·min－1條件下培養48 h后，測定發酵液的蛋白酶、纖維素酶的活力。采用蒽酮比色法測定纖維素酶（CL）催化羧甲基纖維素鈉降解產生的還原糖的含量[29]。每mL樣本每分鐘催化產生1 μg葡萄糖定義為一個酶活力單位（U）。酸性蛋白酶（ACP）、中性蛋白酶（NP）和堿性蛋白酶（AKP）的測定按照GB/T 23527—2 009和相關文獻[30－31]執行。

1.2.3 菌落與菌體形態特征觀察 菌株平板劃線42 ℃分別培養16 h和25 h，在自然光下觀察菌落形態 ；革蘭氏染色后，觀察菌株形態[32－33]。

1.2.4 菌株生理生化特性 試驗參照文獻[34－35]進行。

1.2.5 分子鑒定 菌株的分子鑒定用16S rDNA和gyrB基因進行[36]。利用NCBI網站的BLAST功能對所測的16S rDNA和gyrA序列進行同源性分析，確定親緣關系，使用MEGA 5.0軟件Neighbor-Joining[37－38]構 建系統發育樹，進行1 000次的相似度重復計算。

1.2.6 菌株生長特性 測量菌株的生長曲線，判斷最適生長溫度[39]；對其生長條件進行單因素試驗如表1方案，分析不同因素對菌株生長的影響，其他培養條件和培養基相同，間隔2 h取樣用酶標儀在波長630 nm測吸光度。每組設3個重復。

表1 菌株生長條件單因素試驗Table 1 Single factor test on growth conditions of bacteria

1.2.7 茶渣降解分析 用回接方法，驗證菌株對茶渣降解效果：對照組不添加菌劑；發酵組用LB菌株培養液進行擴大培養制成種子，將培養好的種子接入新鮮茶渣中，攪拌均勻使其菌濃度約為1×106CFU·g－1；對照組和發酵組各裝入9個1 L的三角瓶，每瓶裝量200 mg。兩組同時放入42～45 ℃下的培養箱中；每天搖動三角瓶5 s，發酵7 d結束測定茶渣營養成分的變化。

常規成分測定[40]：粗蛋白、粗纖維和粗灰分分別按GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006和GB/T 6438—2007規定的方法執行。纖維的成分測定[40]：中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）和酸性洗滌木質素（ADL）測定根據GB/T 20806—2006和GB/T 20805—2006方法。氨基酸測定[41]：按GB/T 18246—2000方法，采用全自動氨基酸分析儀 （menbarPureA300）進行測定。

1.2.8 數據分析 所得數據用SPSS 16.0軟件進行分析，F檢驗分析；采用氨基酸分析儀自帶軟件處理數 據。

2 結果與分析

2.1 菌株產酶能力比較

對5株菌的發酵液進行分析，產纖維素酶（CL）活力由高到低分別是DJ、8106、Fb、8116、HLH；酸性蛋白酶（ACP）活力由高到低分別是8106、8116、DJ、HLH、Fb；中性蛋白酶（NP）活力由高到低分別是8106、HLH、8116、DJ、Fb；堿性蛋白酶（AKP）活力由高到低分別是Fb、8116、8106、DJ、HLH（表2）。可見Fb菌產四種酶的活力均較強。

表2 菌株酶活力比較Table 2 Enzyme activities of selected strains

2.2 菌落與菌體形態特征

Fb菌在自然光下，LB培養基，42 ℃培養16 h，其菌落淺黃色，圓形，表面干燥，不透明，邊緣不整齊，如圖1。菌體呈桿狀，(0.4～0.6) μm×(0.9～4.0) μm，單個或成對排列，菌體形態如圖2；芽胞近圓形，近中部生見圖3圓圈標記。

圖1 FB菌落形態Fig. 1 Colony morphology (FB)

圖2 菌體形態Fig. 2 Thallus morphology

圖3 芽孢形態Fig. 3 Strain morphology

2.3 菌株生理生化特性

由表3可知，Fb菌株能水解七葉苷；吲哚試驗陽性；可在β-木糖苷酶、苯丙氨酸芳胺酶、α-半乳糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、L-吡咯烷酮芳胺酶等酶中生長；能利用D-甘露醇、D-甘露糖、古老糖、D-海藻糖、D-葡萄糖、D-核糖等多種糖作為碳源生長；但不能利用肌醇、L-鼠李糖、菊粉、環糊精、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-塔格糖、糖原、麥芽三糖、D-松三糖等。Fb菌株能在低劑量的抗生素中生長，不能在高劑量的卡那霉素耐藥（0.2 g·L－1）、竹桃霉素耐藥（0.1 g·L－1）、多粘菌素B耐藥 （0.031 g·L－1）等培養基生長。

表3 Fb菌株生理生化特性Table 3 Characteristics of Fb

2.4 菌株的分子鑒定

利用NCBI數據庫中的Blast程序分析結果表明，Fb菌株與Bacillus siamensisKCTC 13613T（AJVF 01000043）和Bacillus amyloliquefaciensDSM 7T（FN 597644）菌株的同源性最高，相似性達到99.93%。采用MEGA 5.0軟件，鄰位鏈接法顯示Fb菌株與相關種的16S rDNA序列系統發育樹（圖4）。菌株gyrB測序分析表明，序列長1 176 bp。MEGA 5.0軟件分析結果表明，其與Bacillus velezensisBCRC 17467T（DQ903176）的同源性較高，相似性達到100%。同理將該菌株與其他種屬明確的10株菌的gyrB基因構建系統發育樹（圖5）。

圖4 基于16S rDNA的相似菌株系統發育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strains based on 16S-rDNA differentiation

圖5 基于gyrB的相似菌株系統發育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of strains based on gyrB homologies

結合菌株形態學、生理生化特性以及16S rDNA和gyrB的序列比較分析，將Fb菌株鑒定為貝萊斯芽孢 桿菌（Bacillus velezensis）。

2.5 菌株生長特征

2.5.1 Fb菌的生長曲線 從圖6可以看出，隨著培養溫度的提高，菌株的細胞分裂加快，吸光值增加；Fb菌可在30～60 ℃下生長，其最適的生長溫度 為39～54 ℃。

圖6 培養溫度對菌株生長的影響Fig. 6 Effect of temperature on Fb growth in culture

2.5.2 裝液量和搖床轉速對Fb菌生長的影響 搖床轉速120 r·min－1時，隨著裝液量的增加，菌液的吸光值升高，至裝液量30 mL時，Fb菌的吸光值達最高：0.97；再提高裝液量，吸光值逐漸降低（圖7）。從圖8可知，裝液量30 mL時，隨著搖床轉速的提高，吸光值升高，搖床轉速為120 r·min－1時，Fb菌的吸光值達最高：0.98；再提高搖床轉速，吸光值逐漸降低。表明Fb菌液體培養最佳裝液量和搖床轉速分 別為30 mL和120 r·min－1。

圖7 裝液量對菌株生長的影響Fig. 7 Effect of liquid volume on Fb growth in culture

圖8 搖床轉速對菌株生長的影響Fig. 8 Effect of flask shaking speed on Fb growth in culture

2.5.3 培養時間對Fb菌生長的影響 圖9為Fb菌在培養溫度42 ℃下的生長曲線。0～6 h是菌體適應新環境的遲緩期，細胞分裂增殖緩慢；6～16 h為生長繁殖迅速的對數生長期；16 h的菌體吸光值最高0.974；16～18 h為穩定生長期；18 h后由于自溶酶作用或有毒代謝產物積累，細胞進入衰亡期裂解菌體吸 光值隨之下降。表明Fb菌的最適培養時間為16 h。

圖9 培養時間對Fb菌生長的影響Fig. 9 Growth curve of cultured Fb

2.5.4 初始pH對Fb菌生長的影響 從圖10可以看出，培養基初始pH 4.0～5.0時，菌體吸光值隨pH的提高而提高；培養基初始pH 5.0～7.0范圍內，Fb菌生物量較高且各組間差異不顯著，均高0.93；再逐漸提高培養基的初始pH培養時，菌體吸光值隨之下降；表明Fb菌的培養基最適初始pH為5.0～7.0。

圖10 初始pH對Fb菌生長的影響Fig. 10 of initial pH on enzyme production of Fb

2.5.5 鹽度對Fb菌生長的影響 從圖11可以看出，培養液的鹽度從0.0增加到1.0%，菌株的吸光值也從0.46增加到0.92；培養液的鹽度為1.0%～6.0%，菌株的吸光值均大于0.92，無顯著差異；6.0%～7.0%菌 株的吸光值下降至0.81。

圖11 鹽度對菌株生長的影響Fig. 11 Effect of salinity on Fb growth in culture

2.6 菌株對茶渣降解效果

從茶渣常規營養成分分析看出（表4），發酵組比對照組粗蛋白提高14.88%，水分和粗纖維分別下降42.06%和9.69%，均存在顯著差異。

表4 茶渣常規營養成分的變化（n=9）Table 4 Changes in nutritional composition of tea dregs with Fb inoculation (dry base, n=9) （單位：%）

從茶渣纖維成分分析發現（表5），發酵組比對照組的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和木質素分別下降10.72%、4.47%和11.37%，均存在顯著差異。

表5 茶渣纖維成分的比較（干基, n=9）Table 5 Change on fiber composition of tea dregs by treatment (dry base, n=9) （單位：%）

從茶渣氨基酸的組分和含量可以看出（表6），除胱氨酸、蛋氨酸和組氨酸發酵前后無差異外，兩組均為谷氨酸含量最高，其次天冬氨酸；除胱氨酸、蛋氨酸和組氨酸發酵外，其他14種氨基酸含量均顯著提高（P＜0.05）；氨基酸總量的變化與粗蛋白的變化一致，發酵后其含量提高5.98%，差異顯著。

表6 茶渣處理前后氨基酸含量的比較（干基, n=9）Table 6 Change on amino acid composition of tea dregs by treatment （單位：%）

以上結果表明Fb菌能高效分解茶渣，顯著提高茶渣的營養價值，更好實現茶渣飼料資源化利用。

3 討論與結論

研究表明，在固態發酵中，適宜的水分和原料粒度能夠保證發酵基質深層微生物對氧氣的需求，疏松多孔的基質能促進微生物的代謝廢物及時排出，基質內部的養分也可隨著自由水通過原料間隙擴散到基質表面，滿足基質表面微生物對營養的需求，有利于微生物正常繁殖并保持高產酶活性狀態[1,42]。對于含水率高的物料，一般選擇吸水性強的鋪料如麥麩等來降低物料的含水率；或選擇中高溫菌發酵利于物料中水分蒸發。劉姝等[12]、胡桂萍等[13]、倪星虹[14]和朱飛等[1]均在茶渣中添加不同種類和比例的鋪料進行發酵。本研究獲得貝萊斯芽孢桿菌Fb屬高溫菌，在不添加任何鋪料條件下，新鮮茶渣茶渣經其7 d發酵后水分下降了42.06%（P＜0.05），可有效解決水分過高的問題。這種利用高溫菌發酵分解高水分茶渣的方法不僅能降低生產成本，而且能發酵產生的生物熱加大物料水分蒸發鮮見報道。

本研究中，利用高溫特殊生境分離方法，從廢棄茶渣中分離到有分解茶渣作用的高溫菌5株，其中Fb菌能產生具有較強酶活力的纖維素酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶；與胡寶東等[43]從醬香型大曲中分離獲得的甲基營養型芽孢桿菌（即貝萊斯芽孢桿菌）FBKL1.0190相似。Fb菌經菌落形態、菌株形態、生理生化特性的研究及分子鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）；可耐受55 ℃的高溫，最適生長條件為：42～45 ℃、pH 5.0～7.0、16 h、鹽度1.0%～6.0%、裝液量0.12 mL·min－1、搖床轉速120 r·min－1。茶渣經Fb菌株發酵后，與對照組比，粗蛋白提高14.88%（P＜0.05）；除胱氨酸、蛋氨酸和組氨酸發酵外，其他14種氨基酸含量均顯著提高（P＜0.05），且氨基酸總量提高5.98%（P＜0.05）；這與朱飛等[1]的結果一致，與李芳蓉[44]和張沛[45]的結果相近。另，本研究中茶渣經Fb菌株發酵后與對照組相比粗纖維及其中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和木質素分別下降9.69%、10.72%、4.47%和11.37%（P＜0.05），這與張楠[46]和陳奕業[47]研究的結果相似。此外，本研究分離的Fb菌株的生長溫度均高于他們的發酵菌株，這不僅可減少其他雜菌生長，而且可提高發酵效率。由此可見，Fb菌能有效分解茶渣，提高茶渣的營養價值。但該菌株在發酵分解茶渣的過程中能否產生一些抗菌的活性物質或表面活性素還有待后續的研究。