miR-202-5p在牙鲆性腺中的表達分析及其與cbx2靶向關系驗證

申峰峰 晁青何 黃沁怡 張俊玲,

(1. 上海海洋大學農村農業部淡水水產種質資源重點實驗室, 水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室,水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心, 上海 201306; 2. 青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室, 青島 266071)

性腺發育是行有性生殖動物繁殖的基礎, 也是復雜而高度有序調控的過程, 主要由大量時期差異性表達的基因在轉錄和轉錄后水平調控[1]。microRNAs(miRNAs)是一類長度約為21—23 nt的內源性單鏈小分子RNA。越來越多的研究表明,miRNAs通過與其作用的靶基因3′UTR區結合在轉錄后水平調節基因表達, 進而在性腺發育中發揮重要的調控作用[2—4]。近年來, 一系列與性腺發育相關的miRNAs相繼被發現, 如miR-34c、miR-122a、miR-449a、let-7e、miR-20、miR-106a和miR-202等[5—10]。其中, miR-202-5p是一種在哺乳動物和低等脊椎動物的性腺中大量表達的miRNA。在小鼠中, miR-202-5p在睪丸中表現出特異性的高表達[11];而在人類中, 與正常男性相比, 不育男性睪丸中的miR-202-5p表達量降低了17倍[12]。miR-202-5p在非洲爪蟾(Xenopus laevis)和大西洋比目魚(Hippoglossus hippoglossus)的未成熟或成熟精巢中也表現出特異性的高表達[13,14]; 在斑馬魚(Dnaio rerio)中,miR-202-5p在精巢中特異性高表達, 且在精原細胞和精母細胞中的表達高于精子細胞和精子, 但在卵巢的生殖細胞中幾乎不表達[15]。盡管miR-202-5p在物種間的表達模式已有較多研究, 但對miR-202-5p作用的下游靶基因的研究還十分有限, 對其靶基因的鑒定將對研究miR-202-5p在脊椎動物性腺發育中的功能起到重要的推動作用。

研究發現色素框同源蛋白2(Chromobox homolog 2, CBX2)是多梳蛋白家族(Polycomb group, PcG)的關鍵成員之一[16]。PcG是一類保守的蛋白家族,主要針對一系列與細胞分化、發育相關的基因, 在染色質水平上進行表觀遺傳修飾, 從而達到基因沉默的作用[17]。M33/cbx2缺失的小鼠雌雄性腺均表現出發育不良的現象, 甚至會出現性反轉[18]。在人類中,cbx2突變也會導致類似的性反轉現象[19]。功能分析發現,cbx2突變后將不能與下游靶基因正確結合, 并會結合到不同的序列之上, 喪失對sf1等下游靶基因的調控作用, 進而不能充分調節性腺發育所必需的靶基因的表達[20], 從而造成性腺不能正常發育或性反轉, 表明cbx2可能通過調節性腺發育相關基因的表達在脊椎動物性腺發育過程中發揮作用。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我國重要的經濟海水養殖魚類之一, 與其他硬骨魚類的性腺發育時期劃分相似, 牙鲆性腺發育可以分為Ⅰ—Ⅵ期[21,22]。與牙鲆性腺相關的miRNAs已有一些報道, 但多集中于表達模式的研究[23,24], 而對miRNAs及其靶基因在性腺中的作用研究則鮮有報道。本實驗室長期圍繞miRNAs在牙鲆性腺分化與發育中的作用機制開展研究, 通過精卵巢miRNAs高通量測序發現miR-202-5p在牙鲆性腺中具有豐富的表達。為進一步探討其在牙鲆性腺中的功能, 本研究采用熒光定量PCR確認了miR-202-5p在牙鲆中的組織表達分布, 利用原位雜交技術觀察了其在精巢和卵巢中的定位表達, 并運用生物信息學和雙熒光素酶報告基因實驗鑒定了miR-202-5p與潛在靶基因cbx2的靶向關系, 期望為揭示miR-202-5p在魚類性腺發育中的功能與調節機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用10月齡和12月齡牙鲆來自于中國水產科學研究院北戴河中心實驗站, 無菌解剖獲取精巢、卵巢、腦、心臟、肝臟、腎臟、肌肉和腸等組織樣品, 經焦碳酸二乙酯處理水沖洗干凈, 置于TRizol(Invitrogen, 美國)中勻漿, 用于總RNA提取;另取牙鲆精巢和卵巢組織, 用PBS洗滌后, 立即置于4%的多聚甲醛中固定24h, 用于組織切片制備。

1.2 Real-time PCR

首先采用TRizol法提取上述各組織中的總RNA, 然后分別使用miRcute miRNA first-strand cDNA Synthesis kit(天根, 中國)和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time,TaKaRa, 日本)進行反轉錄, 合成cDNA的第一條鏈,分別用于后續miRNA和mRNA的熒光定量實驗。使用Primer5.0設計牙鲆miR-202-5p和內參基因18S RNA的定量引物(表1)進行熒光定量實驗。

表1 本實驗所用引物Tab. 1 Primers used in this experiment

Real-time PCR反應在CFX96 Touch real time(Bio-Rad, 美國)上進行。根據miRcute miRNA qPCR detection kit(天根, 中國)進行miR-202-5p的熒光定量PCR, 總反應體系為20 μL: cDNA模板1 μL, 上下游引物各0.4 μL, SYBR Green 10 μL及8.6 μL滅菌水。PCR擴增程序為: 95℃, 20s; 60℃, 34s; 進行39個循環反應, 并添加溶解曲線。內參18S RNA基因的熒光定量PCR的反應總體系為20 μL: cDNA模板1 μL, 上下游引物各1 μL, TB Green Premix ExTaqTMII(TaKaRa, 日本)10 μL及7 μL滅菌水。PCR擴增程序為: 95℃, 10s; 60℃, 30s; 進行39個循環反應, 并添加溶解曲線。定量結果采用2–ΔΔCt法計算,獲取miR-202-5p在牙鲆各組織中的相對表達水平,在SigmaPlot 12.5軟件上進行數據分析及作圖, 用Spass 24進行組間顯著性分析, 當P<0.05時視為具有顯著性差異。

1.3 石蠟切片制備與原位雜交分析

將上述固定的牙鲆精巢和卵巢組織樣品使用70%—80%—90%—100% Ⅰ—100% Ⅱ酒精進行梯度脫水, 再經過1/2二甲苯+1/2無水乙醇-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ逐級進行透明, 最后用石蠟進行透蠟和包埋, 制作石蠟切片。為了驗證切片的時期和完整性,首先對切片進行HE染色, 并將驗證好的切片保存起來, 用于后續的原位雜交實驗。

用上述驗證過的精、卵巢切片進行原位雜交實驗。通過與miRBase V20.0數據庫對比發現, 牙鲆miR-202-5p與斑馬魚miR-202-5p完全保守, 因此,牙鲆miR-202-5p探針及原位雜交檢測試劑盒采購自丹麥Exiqon公司,vasa探針合成如下: 使用Primer5.0設計牙鲆生殖細胞標記基因vasa探針合成所需引物(表1), 將片段大小為846 nt的vasa的cDNA片段插入到pGEM-T載體中。根據RNA Labeling kit(羅氏, 瑞士)的說明書, 用spel或sphl將重組質粒線性化, 以轉錄DIG標記的反義或正義探針。合成探針用DNaseI(賽默飛, 美國)孵育, 并加入LiCl在–80℃沉淀2h。原位雜交基本過程如下: 組織切片脫蠟,水化, 于胃蛋白酶消化20min, 漂洗后, 55℃預雜交3h, 地高辛標記的miR-202-5p探針和vasa探針恒溫雜交過夜, 洗滌后封閉1h, 于抗體中孵育過夜, 洗滌后加NBT/BCIP室溫避光顯色30min。使用正置光學顯微鏡(尼康, 日本)對原位雜交結果進行拍照并記錄。

1.4 生物信息學方法預測miR-202-5p的靶基因

本研究根據已篩選獲得的miR-202-5p的成熟序列及NCBI中牙鲆cbx2基因3′UTR序列, 采用RNAhybrid (https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)軟件預測候選靶基因cbx2的3′UTR與miR-202-5p的種子序列的結合位點。

1.5 雙熒光素酶報告基因重組載體構建與酶切鑒定

根據牙鲆cbx2基因3′UTR序列, 使用Primer5.0設計候選靶基因cbx2雙熒光素酶報告基因載體構建引物(表1)進行重組載體構建, 以牙鲆精巢cDNA為模板, 進行PCR擴增出上述候選靶基因的3′UTR片段。反應體系如下: cDNA 1 μL、2×TaqPCR Master Mix酶10 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O補至20 μL。PCR反應程序如下: 95℃預變性3min,95℃變性10s, 60℃退火20s, 72℃延伸50s, 共35個循環。在反應完成后, 將PCR產物進行1%凝膠電泳檢測, 在凝膠成像儀上, 將目的條帶快速切下, 并使用膠回收試劑盒進行純化回收。將回收的目的產物連接到pMD19-T Vector上, 16℃連接16h后轉化到感受態細胞中, 隨后進行藍白斑篩選, 挑取單克隆菌落進行擴大培養, 經菌液PCR驗證后選取陽性克隆送往上海生工生物工程公司測序。

將加有酶切位點的cbx2 3′UTR的質粒與pmir-GLO載體分別用XbaⅠ和SacⅠ限制性內切酶(NEB,美國)進行雙酶切。分別回收目的產物, 并使用T4 DNA連接酶過夜連接, 轉化到感受態細胞中, 藍白斑篩選, 提取質粒后, 經雙酶切和測序驗證后, 將構建成功的重組質粒命名為pmir-GLO-cbx2。

1.6 細胞培養與轉染

本研究所用miR-202-5p mimics購自上海吉瑪基因。采用雙熒光素酶報告基因檢測技術對上述預測的候選靶基因進行鑒定, 具體步驟如下: 將狀態良好的293T細胞接種于24孔板中, 并于10%-FBS培養基中培養, 待細胞密度達到70%左右進行轉染。將1 μg重組質粒和12 pmol的miR-202-5p mimics、negative control mimics和1 μL lipofectamineTM3000 reagent轉染試劑分別用不含FBS和抗生素的細胞培養基稀釋到100 μL(n=3), 將混合液充分混勻, 孵育15min, 分別將混合液加入相應孔內,6h后更換新鮮培養基, 于37℃, 5%CO2環境中繼續培養24h, 空白組僅添加1 μg 重組質粒DNA, 不添加miR-202-5p mimics和negative control mimics, 其余處理方式與上述實驗組相同。熒光素酶活性檢測根據Dual-Luciferase?Reporter Assay System說明書進行, 記錄Firefly Luciferase與Renilla Luciferase比值(n=3), 用 SigmaPlot12.5軟件作圖, 用One-Way方差分析(ANOVA)檢驗各組數據的顯著性差異, 當P<0.05 時視為差異顯著。

2 結果

2.1 miR-202-5p在牙鲆不同組織中的表達分布

采用熒光定量PCR檢測了miR-202-5p在牙鲆不同組織中的表達情況。結果顯示, miR-202-5p在牙鲆性腺組織中表達豐富, 尤其是在精巢中的表達量最高, 卵巢次之, 而在其他組織中的表達量非常低(圖1,P<0.05)。

圖1 miR-202-5p在牙鲆不同組織中的表達分析Fig. 1 The expression level of miR-202-5p in Japanese flounder different tissues

2.2 miR-202-5p在牙鲆雌雄性腺中的定位表達

為進一步檢測miR-202-5p在性腺中的定位表達, 本研究進行了HE和原位雜交分析, 并以生殖細胞標記基因vasa作為定位參考。經HE染色鑒定本實驗所用精卵巢組織為Ⅳ期的精巢和Ⅴ期的卵巢。牙鲆Ⅳ期精巢體積較大, 精巢中的生殖上皮隨著結締組織向精巢內部延伸, 形成許多隔膜, 把精巢分成許多不規則的精小葉, 同一個精小葉里生殖細胞發育不同步。從精小葉結構上看, 生殖細胞沿精小葉由外向里可分為精原細胞、精母細胞、精細胞和精子; 在牙鲆Ⅴ期卵巢中, 既可見Ⅴ期的成熟卵母細胞, 同時也存在Ⅰ—Ⅳ期卵母細胞。原位雜交結果顯示: miR-202-5p僅在Ⅳ、Ⅴ期的卵母細胞中有較強烈雜交信號, 而在其他時期的卵母細胞中雜交信號微弱; 而vasa則是在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等早期的卵母細胞中均檢測到強烈的雜交信號, 在Ⅳ和Ⅴ時期的卵母細胞中雜交信號逐漸減弱。不同的是, 在精巢中, miR-202-5p表現出與vasa相似的表達模式, 其均在精原細胞和精母細胞中檢測到強烈的雜交信號, 而在精子細胞和精子中雜交信號微弱(圖2)。

圖2 牙鲆精卵巢中地高辛標記的原位雜交(ISH)Fig. 2 DIG-labeled in situ hybridization (ISH) in the testis and ovary of Japanese founder

2.3 miR-202-5p與cbx2靶向關系預測

利用生物信息學軟件預測miR-202-5p種子序列與其候選靶基因cbx2的3′UTR區的結合位點, 如圖3所示,cbx2 3′UTR區僅與miR-202-5p的2—8位種子序列第六位不互補, 可能是其潛在的靶基因。

圖3 miR-202-5p靶基因的預測Fig. 3 Prediction of target gene of miR-202-5p

2.4 pmir-GLO-cbx2重組質粒構建與驗證

以牙鲆精巢cDNA為模板, 根據牙鲆cbx2基因3′UTR序列設計特異性引物, 克隆出長度為501 bp的cbx2基因3′UTR片段(圖4, 泳道1), 凝膠電泳條帶大小與預測大小一致, 表明cbx2基因3′UTR片段克隆成功。將構建的重組質粒pmir-GLO-cbx2用XbaⅠ和SacⅠ限制性內切酶進行雙酶切驗證, 得到線性化質粒和cbx2基因3′UTR片段, 凝膠電泳分析顯示兩條條帶大小分別約為7300和501 bp(圖4, 泳道2), 結合公司測序結果, 與預期結果一致, 表明pmir-GLO-cbx2重組質粒構建成功。

圖4 cbx2 3′UTR區克隆及重組質粒雙酶切鑒定Fig. 4 Result of cloning of cbx2 3′UTR region and double enzyme digestion of recombinant plasmid

2.5 miR-202-5p與cbx2靶向關系的鑒定

雙熒光素酶報告實驗結果顯示, 與空白組和對照組相比, mimics組的熒光素酶活性顯著降低, 而空白組與對照組沒有顯著差異(圖5,P<0.05)。結果表明, 過表達miR-202-5p后, 下調了cbx2 mRNA水平, 初步證實了cbx2是miR-202-5p直接作用的靶基因。

圖5 轉染重組載體pmirGLO-cbx2后熒光酶活性分析Fig. 5 Luciferase activity of reporter plasmid containing cbx2 3′UTR

3 討論

本研究首先分析了miR-202-5p在牙鲆不同組織中的表達情況, 結果表明miR-202-5p在牙鲆雌雄性腺中的表達量豐富, 而在其他組織幾乎不表達, 表明miR-202-5p是牙鲆性腺特異并高表達的miRNA,這與先前在斑馬魚[15]和青鳉(Oryzias latipes)[25]中的研究結果一致。在斑馬魚中, miR-202-5p在性腺中具有較高表達, 在精巢中表達量高于卵巢, 且在精原細胞中的表達最強[15]; 在青鳉中, miR-202-5p在精巢中的表達同樣高于卵巢, 在精巢中所有的生殖細胞中均有表達, 但在精原細胞中的表達強于精子[25]。本研究發現miR-202-5p在精巢中的表達量高于卵巢, 原位雜交的結果進一步表明miR-202-5p主要在精巢的精原細胞和精母細胞中表達, 而在精細胞和精子中沒有明顯的信號。這表明miR-202-5p可能在牙鲆精子發生中發揮著重要的作用。據報道, 在雞精巢的生殖細胞中, miR-202-5p在精原細胞中的表達量最高[26]。綜上所述, miR-202-5p在脊椎動物中具有廣泛的物種表達分布, 但在兩性性腺中, 尤其是精巢中具有較高的表達, 這種雄性偏向性的表達模式表明miR-202-5p可能在精巢發育中發揮著重要的作用。

miRNA靶基因的預測與鑒定, 是研究miRNA功能的關鍵依據。雙熒光素酶報告基因檢測技術靈敏度高、操作簡便, 是目前最常用的鑒定miRNA靶基因的一種手段[27]。本研究利用生物信息學和雙熒光素酶報告基因檢測技術鑒定了miR-202-5p的靶基因, 結果發現cbx2是miR-202-5p直接作用的靶基因, 在細胞水平初步明確了miR-202-5p與cbx2之間的負調控關系。先前的研究已表明cbx2是哺乳動物性腺發育調控的重要因子[28]。研究發現,M33(cbx2)基因缺失的雄性小鼠會出現向雌性轉變的現象[29]。Eid等[30]在細胞中對cbx2進行RNA干擾, 發現隨著cbx2被抑制, 減數分裂必不可少的基因-EXO1和雄性發育相關基因sox3的表達量也隨之降低; 而過表達cbx2后,EXO1基因和sox3基因的表達量升高, 與此同時,Pbx1和Fzd1等雌性發育相關基因的表達量出現下降。研究表明,cbx2不僅可以通過調控下游靶基因sf1和NR5A1等的表達,進而調控sry基因的表達, 從而影響雄性性腺發育[20]; 還可以通過直接或間接抑制雌性性別相關基因wnt4和foxl2(forkhead transcriptional factor 2)的表達, 抑制雌性的某些信號通路[30]。此外, 較多的研究也表明cbx2在哺乳動物的細胞周期變化[31,32]、減數分裂、同源染色體的聯會和生殖細胞增殖分化中發揮著較為重要的作用[33]。目前,cbx2基因在魚類中的研究還很少, 本實驗室王新艷等[34]研究發現,cbx2在牙鲆性腺中表達, 暗示cbx2可能在魚類性腺發育中發揮重要作用。晁青何等[35]在青鳉中通過RNAi干擾抑制cbx2的表達發現, 雄性性別相關基因sox9(SRY-related HMG box 9)的表達量降低, 而雌性性別相關基因foxl2的表達量升高, 表明cbx2可能通過調節性別相關基因的表達調控魚類的性腺發育。本研究明確了miR-202-5p與cbx2間存在直接的靶向關系, 表明miR-202-5p可能通過調節cbx2進而在牙鲆性腺發育中發揮重要作用, 為深入研究miR-202-5p和cbx2在牙鲆性腺發育中的作用機制提供了基礎, 而其在牙鲆性腺發育和精子發生中具體扮演著怎樣的角色仍需進一步實驗探討。