槲皮素對(duì)應(yīng)激致小鼠抑郁癥的作用及相關(guān)機(jī)制

華深 羅曉東 徐波 陳建民

應(yīng)激是指生存環(huán)境中多種負(fù)向因素刺激機(jī)體后，導(dǎo)致神經(jīng)、內(nèi)分泌等內(nèi)環(huán)境發(fā)生的變化，適當(dāng)?shù)膽?yīng)激能夠提高個(gè)體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，但過(guò)度應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)心理、生理等障礙，其中以抑郁癥較為常見(jiàn)。相關(guān)研究表明，我國(guó)抑郁癥發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，發(fā)病人群呈年輕化；該病對(duì)患者的正常生活、工作等均有不同程度的影響，甚者可導(dǎo)致患者自殺[1]。槲皮素是植物中類(lèi)黃酮的一種成分，具有抗炎、保護(hù)心血管、治療退化性疾病等作用，目前常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥、肥胖癥等臨床治療[2-4]，而對(duì)應(yīng)激所致抑郁癥的治療研究甚少。基于此，本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)就槲皮素對(duì)應(yīng)激所致抑郁癥的作用及相關(guān)機(jī)制作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性、體質(zhì)量20～25 g、4周齡、清潔級(jí)C57BL/6小鼠90只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究相關(guān)倫理學(xué)要求：分籠飼養(yǎng)于不銹鋼籠內(nèi)，自由進(jìn)食及飲水，每天8：00-20：00給予光照，保持溫度24℃、濕度60%；適應(yīng)1周后經(jīng)一般檢疫均為健康動(dòng)物。

1.2 試劑與儀器 槲皮素（批號(hào)：337951，規(guī)格：純度95%）由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；SuperMaze曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)；Any Maze條件恐懼系統(tǒng)由意大利Ugo Basile公司生產(chǎn)；曠場(chǎng)檢測(cè)系統(tǒng)由上海吉量公司生產(chǎn)；自動(dòng)酶標(biāo)儀DR-200Bs由華衛(wèi)德朗儀器有限公司生產(chǎn)；超聲細(xì)胞粉碎機(jī)scientz-IID由新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)；低溫離心機(jī)由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；小鼠束縛管、懸尾及強(qiáng)迫游泳裝置自制。

1.3 動(dòng)物分組與處理 將90只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、高劑量槲皮素組、中劑量槲皮素組、低劑量槲皮素組，每組18只。除對(duì)照組外，其他4組均采用慢性不可預(yù)知性應(yīng)激制備抑郁模型：應(yīng)激源包括電擊（6 次/d，3 s/次，間隔 3 s）、噪聲（30 min）、晝夜顛倒（12 h/24 h）、閃光（12 h）、濕籠（8 h）、傾籠 45°（24 h）、束縛（3 h）、禁水（24 h）、禁食（24 h）等，每天隨機(jī)選擇 3種應(yīng)激源，但同一應(yīng)激方式不連續(xù)應(yīng)用，連續(xù)給予應(yīng)激4周。從應(yīng)激處理第3周開(kāi)始，高、中、低劑量槲皮素組分別給予5、10、20 mg/（kg·d）的槲皮素（溶于2 ml 0.9%氯化鈉溶液中）灌胃干預(yù)，模型組、對(duì)照組小鼠給予2 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d。本實(shí)驗(yàn)在金華市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成，所有實(shí)驗(yàn)程序按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的批準(zhǔn)協(xié)議進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo) 造模期間，每周記錄小鼠體質(zhì)量變化；造模結(jié)束后，采用曠場(chǎng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠抑郁行為，然后斷頭取腦、分離海馬組織并測(cè)定 IL-1β、TNF-α、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平。（1）曠場(chǎng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)箱中央位置（正中15 cm×15 cm區(qū)域，底面為5 cm×5 cm的9個(gè)方格）放1只小鼠，記錄小鼠15 min內(nèi)活動(dòng)路程，即四肢均進(jìn)入方格的穿越格數(shù)。（2）強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：在一個(gè)安靜的測(cè)試房?jī)?nèi)讓小鼠先熟悉環(huán)境1 h，使其放松；然后將小鼠放入2 000 ml燒杯（水深12 cm，水溫22℃）中6 min，然后記錄后4 min內(nèi)小鼠不動(dòng)時(shí)間，即小鼠漂浮于水面不動(dòng)或在睡眠中輕微游動(dòng)的時(shí)間。（3）懸尾實(shí)驗(yàn)：在一個(gè)安靜的測(cè)試房?jī)?nèi)讓小鼠先熟悉環(huán)境1 h，使其放松；然后用膠帶將小鼠尾巴固定在實(shí)驗(yàn)架上，懸掛6 min，然后記錄后4 min內(nèi)小鼠不動(dòng)時(shí)間，即小鼠停止掙扎后完全不動(dòng)的時(shí)間。（4）海馬組織 IL-1β、TNF-α、5-HT 及BDNF水平檢測(cè)：采用ELISA法。將海馬組織置于0.9%氯化鈉溶液中，按10%比例在0～4℃下制成勻漿，離心后取上清液。使用相應(yīng)的ELISA試劑盒（美國(guó)Sigma公司）檢測(cè)上清液中IL-1β、TNF-α、5-HT及BDNF水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠造模期間體質(zhì)量變化比較 造模第1周，各組小鼠體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模第2周，對(duì)照組體質(zhì)量明顯高于模型組、高劑量槲皮素組、中劑量槲皮素組、低劑量槲皮素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；造模第3、4周，各組小鼠體質(zhì)量比較，對(duì)照組＞高劑量槲皮素組＞中劑量槲皮素組＞低劑量槲皮素組＞模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表 1。

表1 各組小鼠造模期間體質(zhì)量變化比較（g）

2.2 各組小鼠抑郁行為比較 造模結(jié)束后，各組小鼠曠場(chǎng)活動(dòng)路程比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；游泳不動(dòng)時(shí)間、懸尾不動(dòng)時(shí)間比較，對(duì)照組＞高劑量槲皮素組＞中劑量槲皮素組＞低劑量槲皮素組＞模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠抑郁行為比較

2.3 各組小鼠海馬組織 IL-1β、TNF-α、5-HT、BDNF 表達(dá)比較 造模結(jié)束后，各組小鼠海馬組織IL-1β、TNF-α、5-HT、BDNF 表達(dá)比較，IL-1β、TNF-α 表達(dá)為對(duì)照組＜高劑量槲皮素組＜中劑量槲皮素組＜低劑量槲皮素組＜模型組，5-HT、BDNF表達(dá)為對(duì)照組＞高劑量槲皮素組＞中劑量槲皮素組＞低劑量槲皮素組＞模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠海馬組織IL-1β、TNF-α、5-HT、BDNF表達(dá)比較

3 討論

抑郁癥是一種以情緒低落、社會(huì)活動(dòng)能力差等為主要表現(xiàn)的心境或情感障礙類(lèi)疾病，可對(duì)認(rèn)知功能造成影響，進(jìn)而誘發(fā)相關(guān)的軀體性疾病[5]。該病的臨床特點(diǎn)為高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率及高致殘率。目前，臨床上通常采用單胺氧化酶抑制劑、5-HT再攝取抑制劑及三環(huán)類(lèi)、四環(huán)類(lèi)等藥物治療抑郁癥，但這些藥物在緩解抑郁癥狀的同時(shí)伴有不同程度的不良反應(yīng)，具有一定的局限性[6]。故采用積極有效的抗抑郁藥物能夠緩解患者的抑郁癥狀，減少不良反應(yīng)，提高患者治療依從性，對(duì)臨床具有重要的意義。槲皮素又稱(chēng)為櫟精、槲皮黃素，從多種植物的花、葉、果種中提取獲得，屬于天然黃酮類(lèi)化合物，化學(xué)名為3，3'，4，5，7-五羥基黃酮，分子式為 C15H10O7，分子量為302.24[7-8]。目前研究證實(shí)，槲皮素能夠有效治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病、骨科疾病以及心、肝、腎等臟器疾病。聶晶鑫等[9]研究證實(shí)，槲皮素能促使脊髓損傷大鼠神經(jīng)元自噬水平恢復(fù)正常，從而降低脊髓神經(jīng)元損傷程度。雷曉鳴等[10]研究證實(shí)，槲皮素能夠抑制細(xì)胞凋亡，提高全腦缺血/再灌注大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。但關(guān)于槲皮素對(duì)抑郁癥的治療作用相關(guān)研究較少，故本研究作一探討。

研究證實(shí)，慢性應(yīng)激及急性應(yīng)激均能夠誘發(fā)抑郁行為[11]。故本研究采用慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激制備小鼠抑郁模型，并通過(guò)小鼠體質(zhì)量觀察、曠場(chǎng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠抑郁行為，結(jié)果顯示模型組小鼠體質(zhì)量下降，在強(qiáng)迫游泳及懸尾實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，而曠場(chǎng)活動(dòng)路程無(wú)明顯變化，提示抑郁模型構(gòu)建成功。強(qiáng)迫游泳及懸尾實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)意味著絕望和失望時(shí)間延長(zhǎng)，體現(xiàn)小鼠意志減弱，負(fù)面情緒增加，自主行為及探索行為缺乏。經(jīng)槲皮素干預(yù)的小鼠體質(zhì)量明顯增加，強(qiáng)迫游泳及懸尾實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間明顯縮短，且20 mg/（kg·d）劑量組改善最明顯。提示槲皮素具有一定的抗抑郁作用，且與劑量密切相關(guān)。

抑郁癥的發(fā)生與海馬組織結(jié)構(gòu)損傷密切相關(guān)。有臨床試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，長(zhǎng)期應(yīng)激刺激可對(duì)海馬組織造成損傷，同時(shí)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)炎癥反應(yīng)，造成炎癥因子水平升高，最終導(dǎo)致抑郁行為[12-13]。既往研究證實(shí)，慢性應(yīng)激會(huì)介導(dǎo)海馬組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，降低BDNF表達(dá)，而增加BDNF表達(dá)能夠抑制神經(jīng)炎癥及細(xì)胞凋亡[14-15]。5-HT是參與調(diào)控情緒的重要神經(jīng)遞質(zhì)，能作為抑郁癥治療的靶點(diǎn)。因此，本研究對(duì)槲皮素抗抑郁的作用機(jī)制作了進(jìn)一步探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海馬組織IL-1β、TNF-α表達(dá)為對(duì)照組＜高劑量槲皮素組＜中劑量槲皮素組＜低劑量槲皮素組＜模型組，5-HT、BDNF表達(dá)為對(duì)照組＞高劑量槲皮素組＞中劑量槲皮素組＞低劑量槲皮素組＞模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示槲皮素通過(guò)降低IL-1β、TNF-α表達(dá)同時(shí)升高5-HT、BDNF表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗抑郁作用。但本研究?jī)H限于海馬組織，而大腦組織及結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，抑郁癥與前額葉皮層、杏仁核、大腦皮層等情緒相關(guān)部位的機(jī)制如何，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，槲皮素具有抗抑郁作用，其作用機(jī)制可能是降低海馬組織IL-1β、TNF-α表達(dá)，同時(shí)提高5-HT、BDNF表達(dá)。