生物信息學(xué)分析構(gòu)建自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型

劉新會(huì) 劉斐燁

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，是腫瘤相關(guān)死亡的第二大原因[1]。目前，消融、肝切除術(shù)和肝移植是治療肝癌的常用方法，盡管近年來手術(shù)和系統(tǒng)性治療取得了進(jìn)展，但肝癌患者的5年生存率仍低于30%[2]。病理分級(jí)和BCLC分期是影響肝癌患者預(yù)后的重要因素，但現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)即使是相同病理分級(jí)和分期的肝癌患者，其復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)仍各不相同[3-5]。目前臨床仍無可以精準(zhǔn)預(yù)測肝癌患者預(yù)后的指標(biāo)。自噬是一種細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏條件下的分解代謝過程，大量證據(jù)表明，自噬在不同類型的癌癥中上調(diào)或下調(diào)，發(fā)揮著阻礙腫瘤啟動(dòng)或促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的雙重作用[6-9]。同樣，自噬在肝癌發(fā)展和生長過程中發(fā)揮著促腫瘤或抗腫瘤的雙重作用[10]。值得注意的是，雖然多種自噬基因在肝癌中的作用已被認(rèn)識(shí)，但自噬基因表達(dá)水平能否預(yù)測肝癌患者的預(yù)后仍不明確，且多數(shù)研究都集中在檢測單一自噬基因上，對(duì)肝癌中所有自噬基因的表達(dá)水平和預(yù)后預(yù)測價(jià)值仍不明確。基于此，本研究分析癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）肝癌數(shù)據(jù)，明確肝癌組織中所有自噬基因的表達(dá)水平及其在預(yù)測肝癌預(yù)后中的作用，構(gòu)建自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型，其效果獨(dú)立于肝癌患者的臨床特征，能更精準(zhǔn)預(yù)測肝癌患者的生存時(shí)間。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)收集和差異表達(dá)分析 從TCGA肝癌數(shù)據(jù)庫（https://www.cancer.gov/about-nci/organization/research/structural-genomics/tcga,tcga-lihc）下載374例肝癌組織和50例癌旁組織的原始RNA測序數(shù)據(jù)及其臨床特征。采用R語言Limma包分析肝癌組織與癌旁組織間自噬基因的表達(dá)差異，顯著差異表達(dá)基因（different expression genes，DEGs）定義為：和矯正P＜0.05。采用R語言軟件繪制DEGs的火山圖和熱圖。

1.2 DEGs的基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 為進(jìn)一步分析DEGs的潛在分子功能、生物學(xué)過程和細(xì)胞成分的富集情況，采用R語言軟件進(jìn)行GO富集分析[11]，采用clusterProfiler進(jìn)行KEGG富集分析[12]，進(jìn)一步說明與DEGs相關(guān)信號(hào)通路的前景。以P＜0.05為cut-off值，采用ggplot2和GO－plot R語言軟件作圖。

1.3 自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型建立 通過單因素生存分析，明確與肝癌患者總生存時(shí)間（overall survival，OS）顯著相關(guān)的自噬基因。隨后，將前15個(gè)基因納入多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)可獨(dú)立指導(dǎo)肝癌預(yù)后的自噬基因。選取這些基因的表達(dá)值與權(quán)重的線性組合，建立肝癌預(yù)后評(píng)估模型，采用該模型將肝癌患者分為高危和低危亞群。通過Kaplan-Meier生存曲線和log-rank檢驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證高危和低危肝癌患者OS的差異。此外，對(duì)肝癌患者OS進(jìn)行多因素Cox回歸分析，包括腫瘤大小分期（T分期）、腫瘤淋巴結(jié)狀態(tài)（N分期）、腫瘤轉(zhuǎn)移分期（M分期）、病理分級(jí)和臨床分期，同時(shí)計(jì)算HR和95%CI。所有分析都使用3.0.0版本R軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織和癌旁組織之間自噬相關(guān)的DEGs 本研究檢測了TCGA肝癌數(shù)據(jù)庫中203個(gè)自噬基因在肝癌組織和癌旁組織之間的表達(dá)，見表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了60個(gè)自噬相關(guān)的DEGs，其中4個(gè)基因在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，而56個(gè)基因在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，這60個(gè)DEGs的熱點(diǎn)圖見圖1（插頁）。采用KEGG和GO富集分析進(jìn)一步分析DEGs的生物學(xué)功能，見表2～3。KEGG富集的通路包括自噬、HPV感染、細(xì)胞凋亡和p53信號(hào)通路。GO富集的通路包括自噬、自噬調(diào)控和凋亡信號(hào)通路。

表1 TCGA肝癌數(shù)據(jù)庫中60個(gè)自噬相關(guān)DEGs

表2 DEGs的KEGG富集分析

表3 DEGs的GO富集分析

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫肝癌組織和癌旁組織中60個(gè)自噬相關(guān)顯著差異表達(dá)基因（DEGs）的火山圖

2.2 自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型 對(duì)TCGA肝癌數(shù)據(jù)庫中的203個(gè)自噬基因進(jìn)行了單因素生存分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中81個(gè)基因與肝癌預(yù)后顯著相關(guān)，進(jìn)一步選擇前15個(gè)基因進(jìn)行多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)自噬基因（HDAC1、ATIC、EIF2S1和 RAB7A）與肝癌患者的OS顯著相關(guān)，見表4。以多因素Cox回歸系數(shù)為權(quán)重，基于基因的表達(dá)值構(gòu)建自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型。計(jì)算公式具體如下:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（0.385×HDAC1表達(dá)水平）+（0.430×ATIC 表達(dá)水平）+（0.596×EIF2S1表達(dá)水平）+（0.449×RAB7A表達(dá)水平）。按中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將肝癌患者分為高危組（171例）和低危組（172例）。與低危組相比，高危組患者的OS明顯縮短（P＜0.05），見圖2。

圖2 自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型預(yù)測高危或低危肝癌患者的生存曲線

表4 肝癌患者自噬基因的多因素Cox回歸分析

2.3 自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型獨(dú)立預(yù)測肝癌患者預(yù)后 采用單因素分析，進(jìn)一步明確自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型及其他臨床病理因素對(duì)肝癌患者預(yù)后預(yù)測作用，見表5。自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型（P＜0.05）與其他臨床病理因素，包括T分期（P＜0.05）、M 分期（P＜0.05）、腫瘤臨床分期（P＜0.05）與肝癌患者OS顯著相關(guān)，而N分期和病理分級(jí)與肝癌患者OS無關(guān)（均P＞0.05）。進(jìn)一步進(jìn)行多因素Cox回歸分析，以確定自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型對(duì)肝癌患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值是否獨(dú)立于這些臨床病理因素，見表6。盡管自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型、T分期、M分期、腫瘤臨床分期與肝癌患者OS顯著相關(guān)，但只有自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型可獨(dú)立指導(dǎo)肝癌患者的預(yù)后（HR=1.536，95%CI:1.341～1.760，P＜0.05）。

表5 影響肝癌患者預(yù)后的單因素分析結(jié)果

表6 影響肝癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

目前，病理分級(jí)和BCLC分期是評(píng)估肝癌預(yù)后重要的預(yù)測指標(biāo)。然而，有研究報(bào)道，即使是相同病理分級(jí)和BCLC分期的肝癌患者的復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)也各不相同[5]。因此，需要更多的肝癌預(yù)后評(píng)估模型來幫助臨床醫(yī)生選擇精準(zhǔn)化的肝癌預(yù)防和治療策略。越來越多的證據(jù)證明自噬在發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著抑癌或促癌的雙重作用[10，13]，但自噬基因表達(dá)水平能否預(yù)測肝癌患者的預(yù)后仍不明確。

本研究通過對(duì)TCGA肝癌數(shù)據(jù)庫自噬基因的表達(dá)譜分析，確定自噬基因在肝癌中的表達(dá)水平及其在預(yù)測肝癌預(yù)后中的作用。在203個(gè)自噬基因中檢測到60個(gè)肝癌組織和癌旁組織間的DEGs，其中包括了已經(jīng)報(bào)道的 TP73[14]、CDKN2A[15]、SPHK1[16]、FOS[17]等基因，這和本研究結(jié)果一致。但除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)一些新的肝癌組織與癌旁組織間DEGs，這些基因目前在肝癌中的作用仍不明確，例如CAPN10、RB1CC1、RPTOR等，這仍需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

本研究同時(shí)分析明確了這些DEGs在自噬、凋亡和p53信號(hào)通路中富集，這提示自噬在肝癌發(fā)生、發(fā)展中可能共同參與了細(xì)胞凋亡、p53通路激活等相關(guān)信號(hào)通路。近年來已有研究表明，肝癌的發(fā)生、發(fā)展可能與自噬參與的炎癥損傷和氧化應(yīng)激的積累有關(guān)。例如，自噬基因PARP1可以和HBX協(xié)同抑制DNA損傷時(shí)DNA修復(fù)基因的募集，導(dǎo)致?lián)p傷進(jìn)而參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展[18]，這和本研究發(fā)現(xiàn)自噬基因PARP1在肝癌中顯著高表達(dá)一致。

更重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)81個(gè)自噬基因與肝癌患者預(yù)后顯著相關(guān)。其中包括了既往已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的和肝癌預(yù)后顯著相關(guān)的 TSC1[19]、HDAC1[20]、PEA15[21]、SESN2[22]等基因。但仍有部分基因盡管已有研究發(fā)現(xiàn)其參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展，但其能否預(yù)測肝癌患者預(yù)后仍不明確。例如FOXO1在肝癌中已有研究表明可能發(fā)揮抑制肝癌增殖和侵襲的作用[23-24]，但是其能否作為肝癌的預(yù)后指標(biāo)仍不明確，本研究不僅發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中FOXO1顯著低表達(dá)，而且其表達(dá)較低和肝癌預(yù)后較好顯著相關(guān)。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)了一些新的和肝癌患者預(yù)后顯著相關(guān)的自噬基因，如 RAB24、DRAM1、BNIP1、TBK1 等，這些基因仍需要進(jìn)一步研究明確其在肝癌中的作用及具體機(jī)制。

在進(jìn)一步的多因素Cox回歸分析中，基于4個(gè)自噬基因（HDAC1、ATIC、EIF2S1和 RAB7A）成功構(gòu)建自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型。該模型對(duì)肝癌患者的預(yù)后評(píng)估可獨(dú)立于肝癌患者的T分期、M分期、腫瘤臨床分期等其他臨床特征。有研究發(fā)現(xiàn)HDAC1可以通過調(diào)控細(xì)胞有絲分裂參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展，并能預(yù)測肝癌患者的死亡率[25-26]。ATIC通過調(diào)節(jié)AMPK-mTOR-S6 K1信號(hào)通路促進(jìn)肝癌的增殖，并與肝癌預(yù)后較差有關(guān)[27]。這和本研究結(jié)果一致，但RAB7A和EIF2S1在肝癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的作用尚未明確，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過TCGA肝癌數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析確定了自噬基因在肝癌的表達(dá)水平和對(duì)肝癌患者的預(yù)后影響，發(fā)現(xiàn)了60個(gè)在肝癌中顯著表達(dá)差異和81個(gè)與肝癌預(yù)后顯著相關(guān)的自噬基因，這些基因在肝癌中的作用及機(jī)制仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室研究進(jìn)行驗(yàn)證。除此之外，本研究構(gòu)建了自噬基因相關(guān)的肝癌預(yù)后評(píng)估模型，可獨(dú)立預(yù)測肝癌患者預(yù)后，這值得在臨床肝癌患者中進(jìn)一步驗(yàn)證，以用于幫助臨床醫(yī)生選擇精準(zhǔn)化的肝癌預(yù)防和治療策略。